香辛料精油及单体的体外抑菌活性研究

2014-09-10张海江王向红毛宇豪

淮阴工学院学报 2014年5期

张海江，王向红，毛宇豪，孙佳

(淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏淮安 223003)

0 引言

食品在加工、运输、储藏和销售过程中，会由于微生物污染导致食品腐败变质而造成重大经济损失。加入食品防腐剂是一种简单有效避免食品腐败的方法[1]。食品防腐剂包括化学防腐剂、天然防腐剂和复合防腐剂，目前应用以化学防腐剂为主。由于化学防腐剂有一定的毒副作用，对人体健康存在潜在的危害，近年来，随着人们对食品安全要求的提高，天然防腐剂因其高效、安全的特点越来越受到世界各国的重视[2]。我国的天然防腐剂应用有着几千年的悠久历史，主要以传统中药为基础，不仅能够防腐，还可赋予食品独特的风味[3]。本文将系统研究肉桂、丁香、牛至等天然香辛料及其主要成分单体对常见食源性致病菌和腐败菌的体外抑制活性，并考察食物酸碱环境对抑菌活性的影响，为进一步开发高效安全的天然防腐剂打下基础。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

药品：肉桂醛(含量>98%)购自湖北远程共创科技有限公司；肉桂油、丁香油、牛至油、丁香酚(含量>90%)、百里香酚(含量>98%)均购自江西吉安华美植物油提炼厂。经实验室GC-MS和HPLC分析后，各药品均质量合格。除百里香酚精密配制为10%的DMSO溶液外，其余药品均直接用于抑菌试验。

试剂：DMSO、KH2PO4、Na2HPO4均为分析纯，超纯水由实验室Millipore纯水机自制。

1.2 菌种

致病菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)

真菌：酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)

杆菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

以上菌株均由淮安市商品检验检疫局检疫中心提供。

1.3 培养基

孟加拉红培养基用于酵母菌的活化和计数；胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)用于上述致病菌和枯草芽孢杆菌的活化和计数；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)用于上述致病菌和枯草芽孢杆菌的培养；麦芽浸粉肉汤(MEB)用于酵母菌的培养。以上培养基均购于北京陆桥技术有限责任公司。

1.4 仪器与设备

移液枪(雷勃，美国赛默飞世尔科技公司)、恒温摇床(江苏太仓市实验设备厂)、超声波洗涤器(昆山市超声仪器有限公司)、生物显微镜(上海长方光电仪器厂)、pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、pH复合电极(上海盛磁仪器有限公司)、立式压力蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有限公司)、生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(太仓精密仪器设备有限公司)

1.5 方法

1.5.1菌种的活化

无菌室中将供试菌株移接入相对应的试管斜面培养基上，致病菌和杆菌均置37℃恒温培养箱内培养24 h，酿酒酵母菌置28℃恒温培养箱内培养48 h，以活化菌种[4]。0～4℃冷藏，留作备用。

1.5.2菌悬液的制备

取少量经活化的待测菌种，置于装有10 mL 的无菌水试管中，振荡均匀，制成菌悬液。用无菌吸管取1.0 mL 充分混合的菌悬液加入装有9.0 mL 无菌水的试管中，依次进行稀释，最后制成浓度为106～108个/mL的菌悬液，采用显微镜直接计数[5]。

1.5.3培养基制备

分别准确配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液和KH2PO4溶液，按体积比Na2HPO4：KH2PO4=12.3：87.7混合均匀，得pH=6的缓冲溶液[6]。分别以6 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L NaOH溶液调节其pH值，得到pH=5和pH=7的缓冲溶液。分别溶解配制不同pH值的培养基溶液，并以6 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L NaOH溶液调节各培养基溶液的pH值，并用pH计标定，分别制得pH=5、pH=6和pH=7的培养基溶液。

1.5.4抑菌活性测定

1.5.4.1 滤纸片法

将高压蒸汽灭菌过的培养基冷却至50℃左右，移取50 μL菌悬液于上述培养基中，摇晃混合均匀后倾倒在相应的培养皿中，制成含菌平板。将厚度1.5 mm的滤纸用打孔机制成直径为6 mm的小圆纸片，灭菌后分别浸于药液和溶剂中2小时。沥干后贴在含菌平板上，每个培养皿中等距放置4片含药滤纸片，倒置培养一定时间后，测定抑菌圈直径。各菌株的培养温度和时间分别为：致病菌和杆菌为37℃、24 h；酿酒酵母菌为28℃、48 h。各试验平行测定三次[7]。

1.5.4.2 溶液二倍稀释法

(1)样品溶液配制：取无菌试管排成一排。除第1管内加入10 mL培养基溶液外，其余每管加入培养基溶液5 mL。准确移取20 μL各供试精油和20 μL DMSO(助溶)加入至第1管中，超声溶解均匀，得2 μL/mL的药品溶液。从第一管中吸取5 mL含药培养基溶液至第2管，超声混匀后再吸取5 mL至第3管，如此连续倍比稀释得到0.008～2 μL/mL的系列溶液[8]。

(2)阴性对照溶液的制备：试管中加入5 mL培养基，不加供试品。

(3)阳性对照溶液的制备：试管中加入5 mL培养基，按上述样品溶液配制方法中的第1管加药浓度加入供试品。

各试管塞好塞子，置蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20 min。取出冷却后，分别向各管中加入受试菌悬液20 μL，每管最终受试菌的浓度约为105～106个/mL，阳性对照溶液中不加菌。将接种好的试管置摇床培养箱中培养，转速160 r/min。各类菌的培养温度、时间分别为：致病菌和杆菌37℃、24 h；酿酒酵母菌28℃、48 h。取出后，肉眼观察各管的菌株生长情况[9]。阳性对照管溶液澄清透明表明灭菌完全，且培养过程中无污染，阴性对照管溶液浑浊表明各菌株生长良好。以澄清透明的供试药品中最低浓度者为受试菌的MIC。各实验均平行测定三次。

1.5.4.3 pH值对抑菌效果的影响

大多数食品的酸碱环境为弱酸性和中性，即pH值5～7范围。因此，本文按1.5.4.2二倍稀释法，分别测定不同pH(5、6、7)条件下各药品对各供试菌种的MIC值，考察pH值对各药品体外抑菌活性的影响。

2 结果与分析

2.1 滤纸片法

各药品的抑菌圈直径见表1。

表1 几种香辛料精油及单体的抑菌直径(n=3)

抑菌圈判断标准为：直径大于1.5 cm为最敏感型，1.0～1.5 cm为中度敏感型，0.7～0.9 cm为低度敏感型，直径小于0.7 cm为不敏感型[10]。由表1可知，各样品对于常见的致病菌、杆菌、酵母菌均有良好的抑菌效果。其中，肉桂醛和肉桂油的抑菌效果最为明显，除肉桂醛对大肠杆菌为中度敏感外，肉桂醛和肉桂油对其余的供试菌种的抑菌活性都属于最敏感型；丁香油和丁香酚对沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌的抑菌活性为中度敏感型，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌的抑菌活性为最敏感型；牛至油和10%百里香酚对各供试菌种均显示出中度敏感。

2.2 不同pH值下的二倍稀释法测定结果

各香辛料精油及单体的最低抑菌浓度MIC见表2。

各香辛料精油及单体对各受试菌种均显示出良好的体外抑制活性，三次平行试验所得MIC值一致。肉桂醛、丁香酚、百里香酚分别是肉桂油、丁香油和牛至油中的主要成分[11-13]。由表2可见，肉桂油与肉桂醛的MIC相近，二者表现出相似的抑菌活性，说明肉桂醛为肉桂油中的主要抑菌成分，且肉桂油中存在其它抑菌活性物质或其它成分与肉桂醛存在协同增效的作用。同样的情况亦见于丁香油和丁香酚。而百里香酚的MIC均明显小于牛至油，表明百里香酚的抑菌活性好于牛至油。在弱酸至中性条件下，肉桂、丁香精油及其单体的MIC值减小，尤其对枯草芽孢杆菌的抑菌活性明显增强，表明酸度增大对于抑菌是有利的。牛至油及其单体百里香酚的MIC不随pH波动而改变，表明其体外抑菌活性与酸碱度无关。

表2 各香辛料精油及单体的MIC(n=3)

续表2 各香辛料精油及单体的MIC(n=3)

3 结论

研究肉桂、丁香和牛至精油及其单体对常见的食品致病菌和腐败菌的体外抑菌作用，结果表明各精油及单体对各菌种均具有良好的体外抑菌活性，其中对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最强。肉桂醛和肉桂油对各供试菌种的MIC值为0.04～0.50 μL/mL；丁香油和丁香酚的MIC值为0.06～1.50μL/mL；牛至油和百里香酚的MIC值为0.06～1.00 μL/mL。在pH5～7的弱酸至中性条件下，随着酸度增大，肉桂油、丁香油及其单体成分的体外抑菌活性有所增强。

肉桂、丁香、牛至是常见的天然香辛料，应用历史悠久，安全性好。本文研究表明这些香辛料精油及其单体具有良好的天然防腐剂开发价值。

感谢淮安市商品检验检疫局检疫中心为本项目提供受试菌株。

参考文献：

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[2] 钱骅,赵伯涛,夏劲.九种精油的抗菌活性及其防腐特性研究[J].中国调味品,2010,35(4):69-72.

[3] 陆志科,谢碧霞.植物源天然食品防腐剂的研究进展[J].食品工业科技,2003,1(1):94-96.

[4] 沈萍,陈向东.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,2012.14-35.

[5] 沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社, 1999.90-92.

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[9] 陆小军,康梅,徐克和,等.微量稀释法测定抗酵母样菌药物最小抑菌浓度(MIC)的两种终点判定法比较[J].华西医学,1999,14(2):234-235.