叶子花重瓣品种DOD基因序列比对分析

苏进展，王想兰，冯世秀，王晓明，胡章立，陈 涛

(1.厦门日懋城建园林建设股份有限公司，福建 厦门 361101；2.深圳市中国科学院仙湖植物园,广东 深圳 518004；3.深圳大学 生命科学学院，广东 深圳 518060；4.深圳市日昇园林绿化有限公司，广东 深圳 518034)

叶子花属(Bougainvillea)植物是紫茉莉科(Nyctaginaceae)多年生灌木或乔木，有10余种，原产南美洲。栽培品种丰富，苞片颜色极其艳丽多样，有单瓣与重瓣之分，是热带亚热带地区的重要观赏植物，也是研究花色变异和表达的优良材料[1]。重瓣叶子花早在20世纪60年代就陆续在菲律宾培育出来，苞片有红色、粉红色和橙色等[2,3],后在印度进一步培育出花叶重瓣品种[4]。

与其他紫茉莉科和大多数石竹目(Caryophyllales)植物一样，叶子花的苞片色素主要是甜菜色素(Betalain)。甜菜色素是一类植物次生代谢产生的生物碱，主要包括甜菜红素和甜菜黄素[5]。形成甜菜色素的代谢途径主要由DOPA4,5-双加氧酶(DOD)催化调控[6]。研究发现，编码与叶子花同科的紫茉莉(Mirabilisjalapa)的DOD cDNA序列(MjDOD,AB435372.1)，与甜菜(Betavulgaris：BvDOD,AJ583017)有67%的相似度，与大花马齿苋(PhytolacagrandifloraPgDOD,AJ580598)的相似度为63%[7,8]。

光叶子花(BougainvilleaglabraBgDOD,AB435373.1)苞片的DOPA4,5-双加氧酶cDNA全长1 078 bp，具有一个870 bp的开放阅读框(ORF)，编码268个氨基酸[8]。研究根据光叶子花DOD cDNA序列和蛋白质序列(BAG80687.1)设计了一对叶子花DOD基因的特异性开放阅读框引物BdodF/R，以具有不同苞片颜色的5个重瓣叶子花品种为材料，通过反转录克隆其DOD基因的开放阅读框序列，经序列比对来探讨DOD基因与叶子花苞片不同颜色表达之间的相关性。

1 材料和方法

1.1 材料

研究材料选择苞片都是重瓣但颜色各不同或具花叶的5个重瓣叶子花栽培品种(表1)。各品种的花苞片均采自广东省深圳市仙湖植物园叶子花保育与研发基地，用液氮取样固定保存，供RNA提取。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

采用新拓扑生物科技有限公司的新型植物总RNA提取试剂盒提取5个不同重瓣叶子花品种苞片的RNA(具体操作见NeoTopTMplant Total RNA Isolation Kit)，以30 μL DEPC水溶解，于-80 ℃冰箱保存待用。取1 μL总RNA为模板，Random 6 mers为引物合成单链cDNA (具体操作见PrimerScriptTM1stStrand cDNA Kit)，置于-20 ℃冰箱保存待用。

表1 供试RNA提取的样品材料Table 1 Material for RNA extraction

1.3 DOD基因开放阅读框克隆

根据光叶子花DOD基因cDNA序列(BgDOD,AB435373.1)和氨基酸序列(BAG80687.1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司引物设计部设计和合成1对包含开放阅读框序列的特异性引物，预期引物长度870 bp。所设计的引物序列为：BdodF：5′-ATGGGT GGGGAGAAAAAAATG-3′，BdodR：5′-CCAGA AAAAGCAAACACAAGAAG-3′。取1μL上述合成的单链cDNA为模板，BdodF/R为特异性引物PCR扩增cDNA序列，反应条件94 ℃ 4 min变性，94 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，20个循环，每一个循环降1 ℃，94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，20个循环，72 ℃ 7 min，于4 ℃下保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测后送InvitrogenTM广州公司测序。

1.4 DOD基因序列同源性和相似性分析比较

通过转录组测序获得不同叶子花品种的DOD cDNA序列，采用软件ClustalX 2.0[9]进行同源性分析，并将序列数据在NCBI基因库中进行Blast相似性检索，应用软件Mega5[10 ]对近缘物种进行相似性分析，采用最大似然法(Maximum Likelihood Method,ML)构建相似性关系树。

2 结果与分析

2.1 DOD基因的PCR扩增

5个不同叶子花品种的DOD cDNA经过PCR扩增后获得了特异性产物(图1)。这些条带介于700～1 000 bp，与预期长度相符。

图1 5个叶子花栽培品种DOD基因cDNAPCR扩增产物检测Fig.1 Detection of DOD cDNA of five Bougainvillea cultivars from PCR amplification

2.2 DOD基因同源性比较

应用软件ClustalX 2.0对5个重瓣叶子花品种的不同颜色苞片的DOD cDNA序列进行比对分析，结果显示其序列基本相同，同源性达100%(图2)。这些亲缘关系密切的栽培品种，虽然其苞片颜色不同，但调控色素合成的功能基因并没有差异。因此，重瓣叶子花品种的苞片颜色与DOD基因的表达似乎没有直接关联，而应由其他功能基因调控。

2.3 DOD基因相似性分析

将转录组测序获得5个品种的DOD cDNA序列数据与NCBI基因库中近缘种进行Blast相似性检索，重瓣叶子花品种的DOD cDNA序列与光叶子花的(BgDOD)相似度达99%，与紫茉莉的(MjDOD)达84%，与甜菜(BvDOD)达70%，与大花马齿苋(PgDOD)达67%。基于DOD基因序列运用Mega5软件和最大似然法(ML)对叶子花不同重瓣栽培品种及其近缘种进行相似性分析(图3)。

图3 重瓣叶子花栽培品种及其近缘种DOD基因同源性分析Fig.3 Homologous analysis of multi-bracted Bougainvillea cultivars and their close relatives

3 讨论

叶子花的苞片色彩多样，但迄今尚未见有真蓝色。不同色彩苞片的叶子花品种的色素生物合成调控基因序列的比对及其与苞片颜色差异表达的规律分析，对于新花色品种的分子育种具有重要价值。甜菜碱是紫茉莉科、苋科、藜科等大多数石竹目植物花果等器官颜色的主要色素。甜菜色素在植物不同器官中的含量和分布规律与颜色的表达密切相关。DOPA4,5-双加氧酶(DOD)是甜菜色素生物合成过程中的关键酶，对研究花色表达调控至关重要[11]。从花色不同的大花马齿苋、甜菜、紫茉莉和光叶子花中克隆的DOD基因，其序列均有不同程度的差异。试验中的5个重瓣叶子花品种具有共同的来源，都是来自巴特叶子花(Bougainvillea×buttiana)的栽培品种。虽然这几个品种各具有不同颜色的苞片，但调控其色素合成的DOD基因cDNA序列却完全相同，表明不同苞片颜色的表达与DOD基因对色素合成的调控可能并非直接相关。甜菜色素是甜菜醛氨酸与不同氨基酸结合的衍生物，在植物体中表现为红色、紫色和黄色等多种颜色，主要包括甜菜红素和甜菜黄素两种形式，且可随pH值变化而转变[12]。因此，形成叶子花品种不同苞片丰富色彩的物质基础及其表达调控值得进一步深入研究。

参考文献:

[1] 陈涛.叶子花[M].北京:中国农业出版，2008.

[2] Pancho J V.Notes on two outstanding new cultivars ofBougainvilleain the Philippines[J].Lal Baugh J Mysore Hort Soc,1963,8(3):25-26.

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