木薯原生质体培养的影响因子研究

付莉莉+谭德冠+韩冰莹+孙雪飘+张家明

摘要：原生质体技术是细胞工程的核心部分，是进行作物改良和种质创新的重要方法｡；外植体来源及预处理､；酶液组成和浓度､；酶解时间､；酶液渗透压､；培养基组成､；培养方法､；培养密度等对原生质体培养均有很大影响｡；对影响木薯（Manihot esculenta Crantz.）原生质体培养再生植株的相关因素进行了综合分析，探讨了原生质体培养在植物育种上的应用潜力｡；

关键词：木薯（Manihot esculenta Crantz.）；原生质体；培养

中图分类号：S889+5；Q242文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）11-2679-03

Factors affecting Protoplast Culture of Cassava

FU Li-li，TAN De-guan，HAN Bing-ying，SUN Xue-piao，ZHANG Jia-ming

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Haikou 571101，China）

Abstract： Protoplast technology， the core of cell engineering， is the important method of crop improvement and germplasm innovation. Source and pretreatment of explant， solution composition and concentration of enzyme， enzymatic duration，osmotic pressure of enzyme solution， composition of the medium， culture methods， culture density and other factors had a great influence on protoplast culture. The factors affecting plant regeneration from protoplast of cassava（Manihot esculenta Crantz.） were analysized comprehensively. The potential of apply protoplast culture in plant breeding were discussed.

Key words： cassava（Manihot esculenta Crantz.）；protoplast；culture

基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（2010CB126602）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（ITBB110501）；海南省重大科技项目子课题热带生物种质与基因资源研究（ZDZX2013023-1）

植物原生质体是去除了细胞壁的裸露细胞，是遗传改良的重要试验体系之一，可应用于无性杂交､；遗传转化和细胞生理学等领域[1，2]｡；1968年，Takebe等[3]第一个采用商品酶分离得到烟草叶肉原生质体，并于1971年成功再生成植株｡；目前，植物原生质体的研究取得了较快发展，大蒜[4]､；天竺葵[5]､；棉花[6]､；柑橘[7]等的原生质体培养均已获得成功｡；而对木薯（Manihot esculenta Crantz.）而言，其原生质体培养再生植株很难，有关于木薯原生质体分离与培养的报道较少[8-12]，至今未建立系统､；成熟的原生质体培养体系｡；已有研究表明，影响木薯原生质体培养的因素较多且复杂[11]｡；为充分掌握原生质体培养的规律，提高其植株再生频率，本研究从木薯原生质体分离､；纯化､；培养等方面入手，研究影响木薯原生质体培养的主要因素，以期为建立合理､；操作性强的木薯原生质体培养体系提供理论依据，为开展木薯遗传改良和创造新种质提供技术和材料｡；

1外植体来源及预处理

1.1材料来源

生长旺盛､；生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响原生质体的培养及植株再生｡；用于原生质体分离的较好的外植体有叶片､；根､；子叶､；胚､；愈伤组织及悬浮培养物等，尤其是叶片，因为以叶片作材料不仅取材方便，可以分离出大量均匀一致的细胞，而且叶肉细胞排列疏松，易于去除细胞壁｡；目前有关报道中，用于木薯原生质体分离的材料主要是脆性胚性愈伤组织和叶片[8-12]｡；

1.2材料预处理

酶解前对材料进行预处理将有利于原生质体的分离，提高原生质体的产量和活性｡；Wallin等[13]将苹果叶片放入附加5% PVP和0.5 mmol/L蛋氨酸的W5盐-糖溶液中进行处理､；分离，提高了原生质体的产量；Nyman等[14]将草莓试管苗暗培养1周，提高了分离出的原生质体的产量｡；同时，预处理时间对原生质体产量和活力影响也较大｡；用于分离原生质体的木薯脆性胚性愈伤组织无需预处理可直接酶解｡；而对于木薯叶片而言，从原生质体产量､；活力和细胞破碎等方面综合考虑，叶片放入CPW-9M溶液中预处理的最佳时间为0.5～1.0 h[9，11]｡；

2原生质体分离

高质量的原生质体是再生植株的关键｡；研究认为，胞质浓､；不透明､；大小均匀､；呈圆球状的裸露细胞是高质量的原生质体｡；原生质体分离的方法主要有两种：①机械法｡；1892年Klercker首次采用该方法分离植物原生质体，排除了外源酶对原生质体结构和代谢活性的有害影响，但产量较低，因此目前该法使用较少；②酶解法｡；采用不同种类和浓度的酶处理细胞，将细胞壁解离以获得原生质体的方法，可获得大量活力高的原生质体｡；因此，原生质体产量和活力与酶液组成和浓度､；酶液渗透压､；酶解时间等有着密切关系｡；

2.1酶液组成和浓度

用于分离植物原生质体的酶主要有纤维素酶､；半纤维素酶､；果胶酶和离析酶等｡；实践证明，酶液中各种酶的浓度和比例对木薯原生质体的解离效果具有较大的影响｡；酶液浓度过高或过低均不利于原生质体的解离，所以应选择合适的酶液组成与浓度｡；以华南8号木薯为例，木薯叶片原生质体分离适宜的酶液组合为1%纤维素酶+0.5%离析酶+1%半纤维素酶[11]，而文峰等[12]分离木薯TMS60444愈伤组织采用的酶液组合为1%纤维素酶+0.04%离析酶+0.01%果胶酶｡；

2.2酶解时间

酶解处理一般在25 ℃左右､；黑暗条件下进行，通常采用混合酶液一步完成｡；酶解时间从几个小时至几十个小时，依照不同植物和不同外植体而定｡；酶解时间过长对原生质体有伤害，从而影响其产量和活力，而酶解时间过短的话，不能获得足够多的原生质体而满足不了试验需要｡；因此，为了获得大量具有活力的木薯叶肉原生质体，酶解时间一般以14～16 h为宜｡；酶解木薯胚性愈伤组织，时间则长达18 h｡；

2.3酶液渗透压

因为没有了细胞壁，原生质体对外界环境的渗透压较为敏感，酶液的渗透压和原生质体渗透压相差大，会导致原生质体膨胀或收缩而死亡｡；因此，酶液应保持一定的渗透压｡；常用的渗透压调节剂有糖或糖醇（葡萄糖､；蔗糖､；山梨醇､；甘露醇等）｡；此外，盐溶液也可能起到调节渗透压的作用｡；木薯中采用甘露醇（9%）作为渗透压稳定剂｡；

3原生质体培养

3.1培养基

原生质体培养基为原生质体的生长提供营养物质，影响原生质体再生｡；不同作物的培养基不尽相同，同一作物基因型不同其培养基也可能不同｡；培养基的种类直接影响到原生质体的分裂频率､；植板率及愈伤组织的出现等｡；原生质体培养最常用的培养基是MS培养基､；B5培养基和KM8p培养基等｡；培养基中的无机盐､；碳源､；渗透剂和激素在原生质体培养中起重要作用｡；因此，在配制培养基时需要不断对各种元素进行调整，以利于原生质体的培养和植株再生｡；目前报道中用于木薯原生质体培养的培养基不尽相同，MS､；KM8p､；TM2G等均可用于木薯原生质体培养｡；

3.2培养方法

原生质体的培养方法较多，大多数与细胞培养相似｡；主要培养方法有3种，即液体浅层培养法､；固体培养法､；固液双层培养法｡；①液体浅层培养法是目前较常用的原生质体培养方法，是将原生质体纯化后，悬浮于液体培养基中，取少量平铺于培养皿底部，然后封口培养，一般适用于容易分裂的原生质体｡；此方法的特点是操作简单､；易于添加培养液，但容易使原生质体发生粘连，难于定点观察｡；②固体培养法也称为包埋培养法，是将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（如低熔点琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿底部形成一个薄层，凝固后封口培养｡；此方法可有效阻止原生质体的粘连，可以定点跟踪和观察原生质体，但培养基中营养物质不流动，不利于原生质体吸收营养，且原生质体生长过程中释放出的有毒物质不易扩散，而使细胞死亡｡；③固液双层培养法是在培养皿底部先平铺一个薄层固体培养基，凝固后再在其上进行液体浅层培养，结合了液体浅层培养法和固体培养法的优点｡；固体培养基中的营养物质可释放到液体培养基中供原生质体吸收，同时又可吸收液体培养基中细胞释放的有害物质｡；在此基础上还研究了其他方法，如悬滴培养法､；看护培养法､；饲养层培养法等｡；木薯原生质体培养目前采用的方法主要为液体浅层培养法[12]｡；

3.3培养密度

原生质体培养密度对其生长影响很大｡；原生质体培养密度一般在1×104～5×106 个/mL时，植物原生质体才能正常分裂与发育｡；密度过高时，会因为营养不足或有毒物质过多而妨碍细胞的正常生长；密度过低时，则会因为浓度达不到培养条件而使细胞不能持续分裂｡；木薯原生质体培养密度一般在 5×105 个/mL左右｡；

3.4其他因素

除了以上这些因素，光照条件､；温度条件､；pH等对原生质体的分裂､；生长和发育都有重要影响｡；早期，原生质体培养在黑暗条件下进行培养，是因为强光易引起细胞膜发生光氧化反应而损伤；当原生质体再生成愈伤组织时，则将愈伤组织转移至固体培养基上光照培养｡；原生质体培养温度一般控制在25～28 ℃，pH在5.8左右｡；木薯原生质体培养也不例外｡；

4讨论

原生质体在细胞生物学､；生理学､；遗传学和育种学等领域得到了广泛的应用，通过原生质体获得再生植株的植物种类也越来越多｡；但木薯原生质体培养是一项复杂的工程，除了参考已有文献进行研究外，还得考虑外界环境条件等综合分析木薯原生质体植株再生的因素，力求为木薯原生质体再生植株提供较为理想的分离和培养条件｡；木薯原生质体培养的成功将为原生质体融合以及原生质体转化等奠定基础，为细胞工程和基因工程开辟广阔的应用前景｡；

参考文献：

[1] ZHU Y S， CHEN B T， YU S W， et al. Transfer resistance to bacterial leaf blight from Oryza meyeriana via asymmetric somatic hybridization[J].Chinese Sci Bull （in Chinese），2004，49：1395-1398.

[2] NUGENT G D， COYNE S， NGUYEN T T， et al. Nuclear and plastid transformation of Brassica oleracea var. botrytis （cauliflower） using PEG-mediated uptake of DNA into protoplasts [J]. Plant Sci，2006，170（1）：135-142.

[3] TAKEBE I， OTSUKI Y， AOKI S. Isolation of tobacco mesophyll cells in intact and active state[J]. Plant Cell Physiol，1968，9（1）：115-124.

[4] HASEGAWA H， SATO M， SUZUKI M. Efficient plant regeneration from protoplasts isolated from long-term， shoot primordial-derived calluses of garlic （Allium sativum）[J].Plant Physiol，2002，159：449-452.

[5] NASSOUR M， DORION N. Plant regeneration from protoplasts of micropropagated Pelargonium x hortotorum ‘Alain： Effect of some environmental and medium factors on protoplast system efficiency[J]. Plant Science，2002，163：169-176.

[6] SUN Y Q， ZHANG X L， HUANG C， et al. Factors influencing in vitro regeneration from protoplasts of wild cotton （G.klotzschianum A） and RAPD analysis of regenerated plantlets [J]. Plant Growth Regulation，2005，46：79-86.

[7] LIU J H， DENG X X. Production of hybrid calluses via donor-recipient fusion between Microcitrus papuana and Citrus sinensis[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1999，59（2）：81-87.

[8] SHAHIN E A， SHEPARD J F. Cassava mesophyll protoplasts： Isolation， proliferation and shoot formation[J]. Plant Sci Lett， 1980，17：459-465.

[9] ANTHONY P， DAVEY M R， POWER J B， et al. An improved protocol for the culture of cassava leaf protoplasts[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，1995，42（3）：299-302.

[10] SOFIARI E， RAEMAKERS C J J M， BERGERVOET J E M， et al. Plant regeneration from protoplasts isolated from friable embryogenic callus of cassava[J]. Plant Cell Reports， 1998，18：159-165.

[11] 付莉莉，马帅，胡小文，等.木薯叶片原生质体分离条件研究[J].江苏农业科学，2011，39（5）：32-34.

[12] 文峰，肖诗鑫，聂扬眉，等. 木薯脆性胚性愈伤组织原生质体培养与植株再生[J]. 中国农业科学，2012，45（19）：4050-4056.

[13] WALLIN A， WELANDER M. Improved yield of apple leaf protoplasts from invitro cultured shoots by using very young leaves and adding L-methionine to the shoot medium[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1985，5（1）：69-72.

[14] NYMAN M， WALLIN A. Plant regeneration from straw berry（Fragaria × ananssa）mesophyll protoplasts[J]. Plant Physiol，1988，133：375-377.