青杨CCoAOMT基因的克隆及其生物信息学分析

刘红梅+胡尚连+卢学琴+曹颖+任鹏

摘要:以一年生青杨(Populus cathayana Rehd.)嫩茎为试材,利用RT-PCR技术克隆青杨CCoAOMT 基因,并对其进行生物信息学分析｡结果表明,该基因cDNA序列全长为747 bp,是一个编码248个氨基酸的多肽,蛋白分子量为27.67 kD,等电点为5.19,将该基因命名为PcCCoAOMT,其编码的蛋白质为是亲水性蛋白质;氨基酸序列和结构分析表明,CCoAOMT有一个保守区域;系统进化分析表明,PcCCoAOMT与毛果杨的PtCCoAOMT基因具有很高的同源性(87%),该基因功能可能与青杨木质素的生物合成有关｡

关键词:青杨(Populus cathayana Rehd.);CCoAOMT 基因;克隆;生物信息学

中图分类号:S792.113;Q7文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2670-05

Cloning and Bioinformatics Analysis of CCoAOMT Gene in Populus cathayana Rehd.

LIU Hong-mei,HU Shang-lian,LU Xue-qin,CAO Ying,REN Peng

(College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, Sichuan, China)

Abstract: Raw Populus cathayana Rehd. spear of one year was used to clone, the CCoAOMT gene with RT-PCR and its bioinformatics analysis was carried out. The cDNA sequence was 747 bp in length, encoding 248 amino acids. The molecular weight of protein encoded by the CCoAOMT gene was 27.94 kD. Its theoretical PI was 5.19. The CCoAOMT gene was named as PcCCoAOMT. The protein encoded by the CCoAOMT gene was hydrophilic protein. The results of amino acid sequence analysis showed that the protein encoding by PcCCoAOMT contained one conserved domain. Phylogenetic analysis showed that PcCCoAOMT gene had 87% similarity with the corresponding genes PtCCoAOMT in Populus trichocarpa. It may be involued in biosynthesis of poplar lignin.

Key words: Populus cathayana Rehd.;CCoAOMT gene;cloning;bioinformatics

基金项目:四川省“十二五”重点攻关项目(2011YZGG-10)

木质素是植物体中重要的大分子有机物质,仅次于纤维素,在植物抗击外来侵袭､抵御病害袭击､维持正常生长等方面发挥着重要作用[1]｡在制浆造纸过程中,需使用大量化学药品脱除木质素,主要是因为纤维素的结晶度､聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘所致,这不仅提高了造纸成本,更污染了环境[2]｡随着木质素生物合成途径研究的不断深入以及相关基因的成功克隆,运用基因工程等手段调控木质素的生物合成,并将其用于改进纸浆生产､生物燃料､饲料改性已成为可能[3]｡

青杨(Populus cathayana Rehd.)主要产于我国东北､华北､西北和西南等地,耐干旱､耐盐碱､生长速度快｡在造纸业中,由于青杨的木材轻柔､质地净白､不容易腐烂且材质密度适宜而成为重要的原料[4]｡杨树类植物虽然是造纸的好原料,但其木质素含量远远高于纤维素含量,通过克隆其木质素和纤维素的相关基因,运用基因工程的手段提高纤维素含量､降低木质素含量将为造纸业带来新的变革｡

已有研究报道,在植物中已经成功分离克隆了多个木质素生物合成代谢的关键酶基因｡其中的咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因(Caffeoyl-CoA3-O-methyl-transferase,CCoAOMT)是被成功克隆的一类基因[5]｡CCoAOMT基因与加固细胞壁物质的合成有关,研究证实在含有CCoAOMT基因RNAi的植物中,Klason木质素合成量有不同程度的下降,且G/S比例降低[6]｡因此,CCoAOMT基因的研究对木质素含量的降低有重要意义｡目前,从绿竹[6]､拟南芥[7]､水稻[8]､烟草[9]､玉米[10]等植物中已经获取了CCoAOMT 基因｡本研究以青杨嫩茎为试验材料,采用同源技术克隆获得CCoAOMT全长基因,并对其进行生物信息学分析,以期能调控此基因从而降低木质素含量｡

1材料与方法

1.1材料

2013年2月29日以西南科技大学后山苗圃园采集的青杨嫩茎为试验材料,将其迅速用液氮处理,置于-80 ℃保存备用｡以从美国引进的毛果杨(Populus trichocarpa)､我国推广的产业化最好的银腺杂交杨(Populus alba×Populus glandulosa)和广泛分布的山杨(Populus davidiana)作为信息学比较材料｡

1.2主要试剂与菌种

天根植物总RNA提取试剂盒购自成都博瑞克生物技术有限公司;LA-Taq聚合酶､DL2000 DNA Marker､X-Gal､IPTG､PMD19-T Vctor､PrimerScript RT reagent Kit perferct real Time反转录试剂盒､EcoRⅠ､HindⅢ限制性内切酶,均购自大连TaKaRa公司;大肠杆菌DH5α由本实验室保存｡

1.3方法

1.3.1总RNA的提取与cDNA链的合成青杨嫩茎总RNA参照总RNA提取试剂盒的说明书提取,电泳后,在凝胶成像仪上进行观察并拍照｡选取质量较高的RNA,用反转录试剂盒,以Oligo(dT)18为引物,用PrimeScript RT reagent Kit perferct real Time试剂盒进行cDNA的合成｡

1.3.2青杨 CCoAOMT 编码区序列的获得使用软件Primer Premier 5.0根据GenBank上搜索获得的其他品种杨树 CCoAOMT 的核苷酸序列,设计青杨 CCoAOMT 基因的全长克隆引物,上游引物(P1) 5′-ATGGCCACCAATGGAGAGGAACAGC-3′,下游引物(P2) 5′-TCAGATCCGACGGCAGAGAGTG-3′｡以反转录合成的cDNA为模板,采用LA-Taq DNA聚合酶进行CCoAOMT全长序列扩增｡PCR反应条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s;56.5 ℃复性30 s;72 ℃延伸2 min;30个循环;72 ℃延伸10 min;最后4 ℃结束｡PCR扩增产物与pMD19-T Vector进行连接,转化后进行蓝白斑筛选,提质粒,酶切验证并送至上海英俊生物技术有限公司测序｡

1.4青杨CCoAOMT 基因全长序列的生物信息学分析

1.4.14种杨树CCoAOMT 基因编码的氨基酸多序列比对分析青杨CCoAOMT 基因的全长序列,使用了DNAMAN和Clustal W软件,并将其编码的氨基酸序列与GenBank数据库中获得的毛果杨､山杨､银腺杂交杨的全长CCoAOMT基因编码的氨基酸序列进行比对分析｡

1.4.2CCoAOMT 基因系统发育树的构建利用Mega 4.1软件对青杨 CCoAOMT 基因和NCBI数据库中获得的其他物种的CCoAOMT 基因的全长序列进行系统进化树的构建｡对青杨､毛果杨(Populus trichocarpa,登录号XP00231325.1,下同)､银腺杂交杨(Populus alba×Populus glandulosa,AAK1671401)､陆地棉(Gossypium hirsutum,ACF48821.1)､红麻(Hibiscus cannabinus,AFN85667)､枇杷(Eriobotrya japonica,AFZ76980)､白桦(Betula platyphylla,AAW

55668.1)､金鸡纳树(Cinchona officinalis,AAT37172.

1)､构树(Broussonetia papyrifera,AAS91565.1)､圆果桉(Eucalyptus pilularis,BAM05558.1)､中粒咖啡(Coffea canephora,ABO77959.1)､轮叶党参(Codonopsis lancedata,BAE48788.1)､茶树(Camellia sinensis,AFY97680.1)相关数据采取Neighbor-Joining法构建系统进化树｡用Bootstrap对生成的系统进化树校正,生成完整的系统进化树｡

1.4.3CCoAOMT 编码蛋白质的理化性质分析对CCoAOMT 基因进行理化性质分析｡一般采用ORF-finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在线程序分析其开放阅读框,再采用ExPaSy工具(http://au.expasy.org/tools/)中提供的Prot-Param软件在线分析该基因编码的氨基酸的物理化学参数､组成､理论等电点和亲水性｡

1.4.4CCoAOMT 编码蛋白质的二级结构分析分析基因编码的蛋白质二级结构,主要包括α-螺旋(α-helix,H)､β-转角(β-turn,T)､延伸链(Extended strand,E)及无规则卷曲(Random coil,C)等相关数量,利用ExPaSy工具(www.expasy.ch/tools/)中的SOPMA软件在线预测分析4种杨树基因编码的蛋白质二级结构｡

1.4.5CCoAOMT 编码蛋白质的三级结构分析基因编码的蛋白质三级结构预测主要有3种方式,分别为同源模建､折叠识别和从头预测法[11,12]｡利用ExPaSy工具中的CPHmodels程序在线对4种杨树进行同源模建,再利用RasMol预测软件对预测的 CCoAOMT 基因编码的蛋白质三维结构进行分析｡

2结果与分析

2.1青杨 CCoAOMT 基因全长克隆及其编码的氨基酸序列分析

利用RT-PCR技术克隆得到青杨的 CCoAOMT 基因(图1a),全长为747 bp(图1b),通过ORF-finder软件分析青杨 CCoAOMT 基因编码蛋白质的氨基酸序列,得到一个编码248个氨基酸的多肽,命名为PcCCoAOMT｡利用NCBI的Blastp软件进行保守区查找,分析可获得序列的保守区结构域｡结果(图1c)表明,PcCCoAOMT有一个AdoMet_ MTases super family保守区域,证明了青杨CCoAOMT保守区基因编码的蛋白质属于编码S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶基因家族 ｡

2.24种杨树 CCoAOMT 基因编码的氨基酸多序列比对

序列比对结果(图2)表明,PcCCoAOMT基因与毛果杨､山杨和银腺杂交杨CCoAOMT基因编码的氨基酸有高度的同源性,与青杨氨基酸同源性最高的为毛果杨｡青杨CCoAOMT编码的氨基酸比后三者编码的氨基酸多2个连着的苯丙氨酸(F)和天冬酰胺(N),但在最后的位点上发生了一个谷氨酰胺(Q)的缺失｡银腺杂交杨CCoAOMT编码的氨基酸与青杨､毛果杨和山杨CCoAOMT编码的氨基酸比较有8个位点发生了变异:赖氨酸(K)→谷氨酸(E)､谷氨酰胺(Q)→谷氨酸(E)､丙氨酸(A)→未知氨基酸(X)､天冬氨酸(D)→谷氨酸(E)､半胱氨酸(C)→酪氨酸(Y)､苯丙氨酸(F)→酪氨酸(Y)､天冬氨酸(D)→赖氨酸(K)､脯氨酸(P)→丝氨酸(S)｡

2.3CCoAOMT 基因系统发育树的构建

利用Mega 4.1软件构建青杨 CCoAOMT 基因的系统发育树(图3)｡青杨(P.cathayana)､毛果杨(Populus trichocarpa,XP00231325.1)､银腺杂交杨(Populus alba×Populus glandulosa,AAK1671401)､陆地棉Gossypium hirsutum,ACF48821.1)､红麻(Hibiscus cannabinus,AFN85667)､枇杷(Eriobotrya japonica,AFZ76980)和白桦(Betula platyphylla,AAW55668.1)聚为一个类群｡表明这些物种CCoAOMT基因之间的亲缘性较近,其中青杨､毛果杨的CCoAOMT基因亲缘性最近,其他次之｡青杨与茶树(Camellia sinensis,AFY97680.1)､轮叶党参(Codonopsis lancedata,BAE48788.1)､中粒咖啡(Coffea canephora,ABO77959.1)的亲缘性等较远｡推测青杨 PcCCoAOMT与毛果杨 CCoAOMT 的功能相近｡

2.4青杨 CCoAOMT 基因编码蛋白质理化性质分析

青杨､毛果杨､山杨以及银腺杂交杨均属于杨属杨柳科｡从表1可知,青杨CCoAOMT的编码区比其他3种杨树的编码区多3个密码子,其编码的氨基酸比其他3种杨树多1个｡4种杨树分子量差别不大,银腺杂交杨酸性残基数比青杨､毛果杨和山杨多1个;相对碱性残基,青杨比其他3种杨树少1个｡对于理论等电点,毛果杨和山杨相同,但比其他2种杨树略高｡青杨的总亲水性平均系数为-0.232｡青杨PcCCoAOMT的理化性质与毛果杨PtCCoAOMT和山杨PdCCoAOMT基因的更接近｡4种杨树的CCoAOMT基因编码的蛋白分子量在27.81~27.94 kD,酸性残基明显多于碱性残基,这表明4种杨树的蛋白质均表现为酸性蛋白质｡

2.4青杨 CCoAOMT 基因编码蛋白质的二级结构分析

利用SOPMA软件预测4种杨树CCoAOMT编码蛋白质的二级结构,结果见表2｡由表2可知,青杨､毛果杨､山杨以及银腺杂交杨的CCoAOMT编码蛋白质的二级结构中含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,较多的延伸链以及少量的β-转角,预测青杨CCoAOMT编码蛋白质二级结构的α-螺旋比毛果杨､山杨和银腺杂交杨分别少6､8､3个;β-转角比毛果杨､山杨和银腺杂交杨分别少3､1､4个;青杨和毛果杨延伸链一样多,两者均比山杨少3个,比银腺杂交杨少1个;无规则卷曲青杨多于其他3种杨树,山杨的最少｡4种杨树的CCoAOMT编码蛋白质的二级结构整体表现差别不明显,推测4种杨树的CCoAOMT蛋白质的二级结构有很高的相似性｡

2.5青杨CCoAOMT基因编码蛋白质的三级结构分析

利用CPHmodels程序对4种杨树进行CCoAOMT结构的三维建模,预测CCoAOMT基因编码蛋白质的三级结构,预测结果见图4｡由图4可知,青杨､毛果杨和山杨的CCoAOMT基因编码蛋白质的三级结构相似,均含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,还有少量的延伸链和β-转角;青杨､毛果杨､山杨与银腺杂交杨的构象明显不同,因为银腺杂交杨为杂交杨结构,明显比前三者复杂｡

3结论与讨论

目前研究表明,木质素的生物合成受一系列酶的调控催化,木质素由S-､G-和H-木质素3类单体聚合而成酚类多聚体[13]｡CCoAOMT基因对其中的G型木质素合成有特异调节作用,编码的蛋白质是合成木质素有关的酶中比较原始的酶[14],催化木质素生物合成过程中的对-香豆酰莽草酸/奎宁酸(p-coumaroyl shikimate/quinate)C3位置的羟基化反应,且CCoAOMT是木质素基因工程改良应用方面研究的主效基因之一[15]｡

本研究利用同源克隆技术,获得青杨CCoAOMT基因全长序列(命名为 PcCCoAOMT)｡该序列长747 bp ,编码248个氨基酸｡CCoAOMT的氨基酸序列中有一个保守区结构域｡在系统发育树中,青杨CCoAOMT全长基因序列与毛果杨､银腺杂交杨､红麻､陆地棉等聚为一个类群,可以看出CCoAOMT属于编码S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶基因家族｡PcCCoAOMT编码的蛋白质酸性残基多于碱性残基,故此蛋白质为酸性蛋白质,其二级结构含有丰富的α-螺旋和无规卷曲､较多的延伸链以及较少的β-转角｡该基因的分离和克隆为青杨通过基因工程进行遗传改良奠定了基础｡

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