活体自发光成像监测长春瑞滨纳米胶束抗乳腺癌转移机制研究*

张发云 秦 蕾 梁 伟

活体自发光成像监测长春瑞滨纳米胶束抗乳腺癌转移机制研究*

张发云 秦 蕾 梁 伟

梁伟 教授，博士，现任中科院生物物理研究所研究员，博士生导师。2000年于上海医药工业研究院获药剂学博士学位。2000～2004年，先后在美国明尼苏达大学、哈佛大学医学院、东北大学从事博士后研究工作。现任蛋白质与多肽药物实验室副主任、中国生物物理学会第九届理事会理事、中国生物物理学会分子影像学专业委员会副主任委员、中国药学会药剂专业委员会委员、《纳米科学与技术》丛书编委会编委等职。主要研究药物新型输送系统和药物新靶标的发现。提出并实现了利用胶束运载抗肿瘤药物到达实体瘤内部深层细胞，提高了药物的疗效、降低了毒副作用，为临床肿瘤治疗提供新的策略；发现组织纤维化为肿瘤细胞的生成和发展提供了有利的微环境,促进肿瘤生长和转移，TGF-β/Smad3信号通路在这一过程中起到关键作用并作为药物筛选的新靶点。主持项目包括国家新药创制重大专项、科技部973、重大科学研究计划等。研究成果入选2007年“中国科技十大进展新闻”，获2008年中国药学会科学技术奖（二等奖）、2010年第十二届中国专利优秀奖、2012年国家自然科学奖（二等奖）。授权发明专利9项，在JNCI、ACS Nano、Cancer Res等国际重要刊物发表研究论文40余篇。

目的：乳腺肿瘤细胞的转移是乳腺癌致死的主要原因。淋巴转移作为血道和淋巴两大转移途径之一，在乳腺癌转移过程中至关重要。针对乳腺癌转移的特点，本研究组设计了具有淋巴富集特性的纳米载药系统，活体动态监测其对原位乳腺肿瘤生长以及肺脏和淋巴器官转移的抑制效果，旨在为临床用药提供科学依据。方法：采用活体自发光成像实时动态地监测了聚乙二醇化磷脂（PEG-PE）包载的长春瑞滨纳米胶束抗乳腺癌体内转移的过程。结果：与未包载的游离长春瑞滨（Free Vin）相比，PEG-PE包载的长春瑞滨胶束（NanoVin）增强了长春瑞滨的抗原位瘤活性，显著抑制了乳腺肿瘤细胞的淋巴及肺脏转移。结论：通过静脉给药达到了血道转移和淋巴转移两条途径的双重清扫，为靶向药物设计提供了新思路。活体光学成像技术可动态监测肿瘤的转移，为临床应用影像技术检测药物疗效提供必要的技术手段。

长春瑞滨纳米胶束 活体光学成像 乳腺癌 淋巴转移

肿瘤转移是肿瘤细胞从原发部位经过一系列步骤到达宿主远端组织或器官后得以继续生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的过程［1］。临床数据表明，90%的肿瘤患者最终死于转移［2］。因此，研究开发抗肿瘤转移的药物尤为重要。

淋巴转移和血液转移是肿瘤转移的两个主要途径。在乳腺癌等多种实体瘤中，肿瘤早期通过淋巴转移［3］。在肿瘤晚期，则会发生血液转移。因此，抑制这两个途径的转移十分重要。然而，静脉注射的纳米药物往往粒径很大，难以被淋巴摄取。而淋巴靶向给药可以直接被淋巴系统摄取，但对血液转移抑制作用有限。研究发现，药物尺寸大小是影响淋巴摄取和淋巴结滞留的重要因素之一［4］。粒径小于10 nm的粒子被优先重吸收进入毛细血管，而淋巴摄取粒子的最佳粒径则在10～30 nm之间。纳米胶束载药系统是近年来兴起的一类给药系统。目前，已有胶束制剂处于研发和临床实验阶段，如Genexol-PM、NC-6004、NK911等［5-7］。本实验室研究发现，采用嵌段共聚物聚乙二醇化磷脂（PEG2000-PE）包载阿霉素胶束表现出比游离阿霉素更优越的抗原位瘤和转移效果［8］。继而本研究对胶束的抗转移机制进行了考察，发现经PEG-PE包载后的胶束粒径在14 nm左右，能从正常血管中以完整形式渗出，较游离药物在淋巴结中滞留更长时间，提示我们该胶束可能具有更好的抗淋巴转移效果［9］。

活体光学成像技术是近几年来发展成熟的分子影像新技术，现已被广泛应用于实时、连续、直观地观测活体内肿瘤细胞的生物学行为。为进一步研究PEG-PE包载药物胶束的抗转移效果，本研究采用活体自发光成像技术，对胶束包载的长春瑞滨抗乳腺癌的转移疗效进行实时、连续动态的监测，并就载药胶束抗乳腺癌转移的机制进行探讨，以期深入了解药物和载体的特性，为开发有效抗肿瘤转移的新型药物提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与实验动物

鼠源乳腺癌细胞4T1购自ATCC。RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，细胞培养用胎牛血清购自德国PAA公司。磷脂及其衍生物：PEG2000-DSPE购自美国Avanti Polar Lipids公司。长春瑞滨酒石酸盐（Vinorelbine tartrate）为浙江民生制药厂提供。实验动物雌性BALB/c小鼠，18～20 g，6～8周龄；购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2012-0001］。

1.2 方法

1.2.1 长春瑞滨胶束的制备 将适量PEG2000-PE溶于氯仿，摇匀后旋转蒸干成脂膜，真空干燥至少1h除尽残留的有机溶剂。加入去离子水水化脂膜，使得溶液中PEG-PE的浓度为40 mg/mL。55°C水浴水化30 min，室温静置2 h使其充分组装即得到空白胶束储液。将长春瑞滨酒石酸盐溶于去离子水制得4 mg/mL的药物水溶液。将该药物水溶液与40 mg/mL的空胶束等体积混合，55°C水浴水化30 min，室温静置2 h使其充分包载药物，即制得载药胶束储液，所得载药胶束的药脂比为1∶10（w/w）。将制得的药物采用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，备用。

1.2.2 长春瑞滨胶束对原位瘤生长抑制作用的考察 雌性BALB/c小鼠30只，于第四乳腺垫皮下接种4T1-Luc2乳腺癌肿瘤细胞（Caliper Co.）（10万/只）。接瘤后第4天，采用精诺真活体自发光成像系统（IVIS，Spectrum）检测其原位肿瘤的光子数。依据光子数平均值相接近且从大到小均散分布的原则对小鼠进行分组，每组10只。在接瘤第5天，采用尾静脉注射给药，每周一次，共2次。1）NanoVin治疗组：尾静脉注射NanoVin 10 mg/kg（含Free Vin 10 mg/kg）；2）Free Vin治疗组，尾静脉注射Free Vin 10 mg/kg；3）Control对照组，尾静脉注射PBS溶液0.2 mL/20 g。于接瘤后第14天和第21天，采用活体光学成像监测原位肿瘤光子数并成像。在成像前，每只小鼠采用2.5%异氟烷气体麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin荧光素（Caliper Life Sciences）。15 min后，采用自发光成像对小鼠进行整体成像。其原位肿瘤部位的光子数采用成像系统光子数测定软件计量。

1.2.3 长春瑞滨胶束对乳腺癌转移作用的考察 雌性BALB/c小鼠42只，其接种乳腺肿瘤方法和接瘤后给药方式均与1.2.1方法相同。按平均光子数相同随机分为对照组（Control）13只，游离长春瑞宾组（Free Vin）13只，长春瑞宾胶束组（NanoVin）16只。采用活体自发光成像系统监测第14天和第21天小鼠肺部肿瘤转移部位的光子数并成像。在成像前，每只小鼠采用2.5%异氟烷气体麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin荧光素。15 min后，采用自发光成像对小鼠进行整体成像。为避免原位肿瘤强烈的发光信号对肺部转移肿瘤发光信号的影响，我们采用黑色不透光袋将原位肿瘤遮住，只针对肺部转移肿瘤进行成像。其肺部转移肿瘤部位的光子数采用成像系统光子数测定软件计量。接瘤第31天，小鼠异氟烷麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin荧光素。15 min后，把小鼠断颈处死，实施肺脏和淋巴结的解剖手术，淋巴结的分离包括腋下淋巴结（左侧2～3枚，右侧2枚），右侧腹股沟淋巴结（1枚）。并对离体的小鼠肺脏和淋巴结进行自发光的成像光子数监测同时成像，其肺部和淋巴结中肿瘤光子数采用成像系统光子数测定软件计量。

1.3 统计学分析

以SPSS 17.0软件分析数据，采用单因素方差分析，数据以±s形式记录。两组间统计学显著性差异检验采用Student t-test。其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.005。

2 结果

2.1 长春瑞滨胶束对4T1-Luc2乳腺癌原位瘤生长的抑制作用

为考察长春瑞滨胶束对4T1-Luc2乳腺癌原位瘤生长的抑制作用，在乳腺垫原位接种第4天成像并分组。第5天，分别采用PBS，游离长春瑞滨和长春瑞滨胶束给药治疗。在接瘤第14天，第21天采用活体光学成像系统监测小鼠乳腺垫原位的肿瘤光子数。与对照相比，给药组小鼠的原位肿瘤光子数均有减少。长春瑞滨胶束治疗组较游离长春瑞滨药物治疗组减少更明显（图1A、B）。此外，第31天原位肿瘤解剖照片也表明长春瑞滨胶束治疗组可显著抑制原位肿瘤的生长（图1C）。

2.2 长春瑞滨胶束对4T1-Luc2乳腺癌肿瘤肺部转移的抑制作用

为考察长春瑞滨胶束对乳腺癌转移的影响，在接瘤第14天，第21天采用活体光学成像系统监测小鼠肺部肿瘤转移部位的光子数。结果发现，在接种第14天和第21天，与对照组相比，游离长春瑞滨药物治疗组和长春瑞滨胶束治疗组的肺部转移瘤光子数均有减少，尤以胶束组减少的最多，提示长春瑞滨胶束能有效抑制乳腺癌肿瘤细胞向肺部的转移（图2A、B）。同时，第21天肺部转移肿瘤的自发光成像图片显示，对照组中仅有一只肺部未见转移，而在游离长春瑞滨药物治疗组和长春瑞滨胶束治疗组的肺部未见转移小鼠数量增加，尤其胶束组肺部未见转移小鼠数量最多（5/16）（图2C）。第23天肺部解剖照片也显示长春瑞滨胶束治疗组的肺部转移肿瘤的结节数最少（图2D）。接瘤第31天，将解剖的肺脏和淋巴结进行成像监测发现，与对照组相比，游离长春瑞滨药物治疗组肺脏平均光子数为2.40×109vs.3.73×109（p/s/cm2/sr），差异为 1.33×109（P=0.33，Independed-samples t test）。长春瑞滨胶束药物治疗组肺脏平均光子数比对照：T/C是0.17（平均值为6.33×108vs.3.73×109（p/s/cm2/sr），差异为3.10×109（P=0.004，Independed-samples t test，图3A）。解剖分离的肺部自发光成像图片也显示与游离长春瑞滨治疗组的小鼠肺部和淋巴结转移瘤相比，长春瑞滨胶束治疗组的小鼠肺部的转移显著减少（图3B）。

图1 光学自发光成像监测长春瑞滨胶束抑制4T1-luc2原位肿瘤光子不同时间成像与增长曲线图Figure 1 Bioluminescence photon imaging and growth curve of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on 4T1-luc2 primary tumors

2.3 长春瑞滨胶束对4T1-Luc2乳腺癌肿瘤淋巴结转移的抑制作用

在前期的预示验中，我们发现，在乳腺癌原位接瘤后20天后才会出现小鼠淋巴结部位的转移。因此，本研究中考察了接瘤第31天接瘤小鼠淋巴结的转移情况。结果发现，对照组淋巴转移小鼠个体发生率为46.2%（6/13），游离长春瑞滨药物治疗组为30.8%（4/13），而长春瑞滨胶束治疗组仅有7.8%（1/13）（图4B）。而对比发生转移的淋巴结个数则发现，游离长春瑞滨治疗组（9个）＞对照组（7个）＞长春瑞滨胶束治疗组（1个）（图4C）。解剖的三组淋巴结成像如图4A所示。

图2 光学自发光成像监测4T1-luc2乳腺癌肺部转移肿瘤光子量成像图Figure 2 Bioluminescence photon imaging of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on lung

图3 光学自发光成像监测4T1-Luc2肿瘤原位接种第31天解剖肺组织的转移肿瘤光子成像图Figure 3 Bioluminescence photon imaging of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on lung metastasis of 4T1-luc2 breast cancer on day 31

图4 光学自发光成像监测4T1-luc2肿瘤原位接种第31天淋巴结解剖成像图Figure 4 Bioluminescence imaging of lymph node metastases on day 31 after treatment

3 讨论

本实验采用活体自发光成像实时、动态、直观地考察了PEG2000-PE包载的长春瑞滨胶束抗乳腺癌原位生长和转移的治疗效果，发现长春瑞滨胶束在抑制原位瘤生长、阻止其远端转移，尤其是淋巴结的转移方面表现出明显优于游离长春瑞滨的治疗效果。

目前，针对肿瘤的纳米载药系统一般都是基于EPR理论，即实体瘤组织由于血管内皮细胞间隙大，血管通透性高，且缺乏淋巴回流，造成大分子药物易透过肿瘤组织血管并在肿瘤组织中有高浓度的滞留累积［10］。故传统的被动靶向纳米制剂为了增加EPR效应，粒径一般较大，如处于临床或临床前研究的胶束制剂Genexol-PM、NK911、NC6004的粒径分别在90、40、30 nm左右［5-7］。然而最近的研究表明，由于纳米制剂的渗出受血管通透性的严格限制，在直径小于2～3 mm的微小肿瘤，如转移瘤中，由于血管结构相对完好，粒径在48 nm左右的胶束无法从该处渗出发挥作用［11］。因此，传统纳米载药系统虽然可以有效控制原位瘤，但对转移，尤其是淋巴系统的转移却不能产生很好的抑制效果。而本研究采用的PEG-PE长春瑞滨胶束粒径为14 nm，可以从正常血管中以完整形式渗出，较未包载游离药物更多的在淋巴系统富集［9，12］。本研究通过活体成像实时动态地考察了长春瑞滨胶束抗乳腺癌转移的效果，直观有力地证明了长春瑞滨胶束能有效杀死血液和淋巴系统这两条路径中转移的肿瘤细胞，因此比游离药物有更好的抗转移效果。

本实验组已有研究表明，化疗药物经PEG-PE胶束包载后，在提高抗肿瘤活性的同时降低药物对机体的毒副作用。PEG-PE胶束包载阿霉素后能明显降低阿霉素的心脏毒性［8］。本研究中NanoVin只增加了对肿瘤细胞的细胞毒作用，而对正常细胞无毒性。NanoVin这种选择性的细胞毒作用有助于它杀死肿瘤细胞并降低机体毒性［12］。NanoVin的低毒性也反映在其半数致死剂量LD50相比游离长春瑞宾增加了70%［9］。此外，NanoVin具有较小的骨髓抑制性，对注射部位的组织和血管非常低的刺激性，并大幅度的减少长春瑞宾对CYP3A4活性的抑制。NanoVin的这些特性均表明其减少了长春瑞宾药物的毒副作用。

在本文中我们采用活体自发光成像技术考察了胶束包载药物对抗转移效果的影响。活体自发光成像因具有敏感性高，抗干扰能力强，以及穿透力强的特点被广泛应用于肿瘤细胞的侵润和迁移检测，尤其是微转移灶的检测上［13］。通过对同一组小鼠在不同时间点进行记录，直观动态地监测乳腺癌的生长并跟踪肿瘤的转移，使实验有很好的连续性，因此数据更加真实可信。我们对胶束包载的长春瑞滨抗乳腺癌转移的疗效进行了实时、连续动态的监测，为开发有效的抗乳腺癌转移的新型纳米药物提供了新的思路。

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（2013-09-26收稿）（2013-10-11修回）

Monitoring anti-metastasis effect of vinorelbine-encapsulated micelles on breast cancer by bioluminescence imaging

Wei LIANG;E-mail:weixx@sun5.ibp.ac.cn
Protein and Peptide Pharmaceutical Laboratory,Institute of Biophysics,ChineseAcademy of Sciences,Beijing 100101,China.

Objective:Breast cancer metastasis is a major cause of death.Lymphatic metastasis is one of the two main metastatic ways that is crucial to the metastasis process of breast cancer.To treat breast cancer metastasis,we prepared micelle-based drug carrier for lymphatic delivery.Methods:We used in vivo bioluminescence imaging for real-time dynamic monitoring of the inhibitory effect of polyethylene glycol phospholipid micelle encapsulating vinorelbine on breast cancer metastasis.Results:Compared with the free vinorelbine,vinorelbine-encapsulated micelles(NanoVin)showed a significantly enhanced anti-tumor activity both in primary and metastatic tumors.Conclusion:Intravenous administration of NanoVin markedly prevented the metastasis of tumor cells through both hematogenous and lymphatic systems.This study provides a new approach for treatment of metastatic tumors.Bioluminescence imaging is a powerful tool to dynamically monitor tumor metastasis and clinical therapeutic effect of anticancer drugs.

vinorelbine-encapsulated micelle,bioluminescence imaging,breast cancer,lymphatic metastasis

中国科学院生物物理研究所，蛋白多肽药物实验室（北京市100101）

*本文课题受国家重大科技专项973计划项目（编号：2011CB707705）资助

梁伟 weixx@sun5.ibp.ac.cn

10.3969/j.issn.1000-8179.20131858

Fayun ZHANG,Lei QIN,Wei LIANG

This work was supported by The State Key Development Plan Project(No.2011CB707705).

（本文编辑：郑莉）