在基因序列中高效引入多位点突变的方法

孟凡荣 陈琛 李永文 万海粟 周清华

在基因序列中引入点突变，是研究基因的结构和功能及其相关性的重要手段[1,2]。例如，当所研究的基因是蛋白编码基因时，在蛋白编码框架内引入点突变，就可以改变蛋白编码序列，而突变基因在相关研究体系中功能的变化，则可以为该基因的功能特点的研究提供依据。体外基因突变已经成为分子生物学实验室的一项常规工作。为适应这一需要，已经有多种在基因序列中引入点突变的方法可以使用[3-5]。目前最常用的方法QuickchangeTM占据了主流的位置，当然，也存在其它许多可以实现基因定点突变的方法，但这些方法中，基本都是对在单一位置引入点突变较为有效，而对在基因序列的多个位点引入突变则并不有效。为解决这一问题，有Ko等[6]提供了一种可以在体外基因序列中引入多个点突变的方法，但这种方法含有琼脂糖凝胶电泳的步骤，以及其后的DNA片段的回收，操作过程极为繁琐，因此，并不太适合作为实验的常规方法使用。本研究在这些方法的基础上，提供一种非常简便有效的在基因序列中引入多位点突变的方法，本研究所提供的方法主要实验步骤可在一天之内完成，突变效率可接近100%[7-9]。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究使用的基因序列是pEN载体，其中含有nm23和绿色荧光蛋白（enhanced green fluorecence protein,EGFP）之间的融合基因，该载体为实验室常规保存。PCR反应所用试剂盒PrimeSTAR HS DNA Polymerase（DR010A），T4DNA连接酶（T4 DNA ligase, D2011），DNA纯化DNA Fragment Purification Kit（DV807A,TaKaRa）及DH5alpha菌株为宿主，均购自Takara（大连）公司。限制性内切酶Esp 3I及Dpn I为Fermentas产品。质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 在一段位于pEN载体的基因序列中引入多位点的定点突变时，针对每一个突变位点，合成一对引物，待突变的位点则位于该引物序列之中，而每一个引物中均含有限制性内切酶Esp 3I位点。则每个扩增片段的两端都含有一个Esp 3I位点。实验所用的突变引物由Takara合成，具体序列见表1。

1.2.2 PCR产物制备 PCR反应利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase及其中的反应试剂（DR010A, Takara）进行。反应体系为100 μL，含有以下成分：1×Prime STAR buffer；dNTP Mixture，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的终浓度均0.25 nM，Primer A、Primer B的终浓度均为0.25 μM，质粒DNA（pEN载体）20 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 2.5 U。PCR反应循环条件为：预变性95oC、30 s后进入循环，98oC、10 s变性，62.5oC、30 s退火，72oC、5 min复性，共28个循环，继续72oC延伸10 min后终止反应，产物4oC保存备用。

1.2.3 模板质粒DNA的去除 将上一步骤的PCR产物转入37oC水浴，直接加入限制性内切酶DpnI 40 U（Fermentas）酶切1 h-2 h。对所得DNA产物进行纯化，所用试剂盒为DNA Fragment Purification Kit（DV807A,TaKaRa），30 μL水复溶。

1.2.4 连接末端的形成及连接反应 对扩增产物用Esp 3I对其进行酶切，从而将引物序列中非特异的序列部分去除并形成连接末端，具体反应条件为：将以上纯化后的扩增产物放入50 μL酶切体系中，其中含有Esp 3I量为20 U（Fermentas），其它条件与厂家要求一致，37oC水浴2 h。实验接着对所得酶切产物进行纯化，所用试剂盒为DNA Fragment Purification Kit（DV807A, TaKaRa）。最后，所得DNA纯化产物进行连接反应（T4 DNA Ligase,Takara），16oC水浴1 h-2 h。

1.2.5 化学转化DH5alpha感受态细胞 取所得连接产物1 μL，转入100 μL感受态细胞混匀，冰上30 min，42oC水浴1 min，然后将受体菌加入到预热至37oC未加抗生素的LB培养基悬浮，37oC摇床培养1 h，200 rpm/min。涂布于含卡那霉素的LB平板，37oC培养过夜后挑单菌落鉴定质粒。

1.2.6 突变质粒的鉴定和基因序列的测定 质粒小提试剂盒提取质粒，含有突变基因的质粒，利用Sanger测序法进行测序验证（华大基因科技服务有限公司，北京）。

2 结果

2.1 在基因序列中引入多位点突变的流程 在一个位于某个表达载体的基因序列中引入多位点的定点突变时，针对每一个突变位点合成一对引物，待突变的位点则位于该序列之中，而每一个引物中均含有一个合适的Type IIs类的限制性内切酶的位点，一般情况下，我们使用Esp 3I位点。当然，也有许多其它的该类型的限制性内切酶位点可以使用。这一类限制性内切酶的特点是，其在底物DNA序列上的识别位点与其在底物序列上的酶切位点是分离的[10]。常用的Esp 3I限制性内切酶的识别位点和酶切位点被置于突变引物序列的5’端，而突变位点和周围的特异序列，则被置于突变引物序列的3’端。如图1所示，实验首先利用常规的PCR反应，对邻近两个突变位点之间的序列进行扩增，假定需要在基因序列中引入4个位点的突变，则可以将载体分别扩增为4个片段，其中，每个扩增片段的两端都含有一个Esp 3I位点，然后借助Dpn I限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，以消除作为扩增模板的质粒，防止其在后续的实验中形成假阳性克隆[11]。实验接着利用对应的Type IIs类的限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，从而将引物序列中非特异的序列部分去除并形成连接末端，然后，借助T4 DNA连接酶做连接反应，以形成突变载体。和其它类似的方法比较，我们这里提供的方法中，没有任何DNA电泳和回收的步骤，因此，在实验操作时非常简便易行。

2.2 在nm23-EGFP融合基因序列中引入3个和4个位点的突变 为验证以上实验方法是否可行，我们利用在pEN载体中含有的nm23-EGFP融合基因中引入3个-4个突变来进行验证[12]。如图2所示，实验共选择在4个位点，分别用下划线标注，被称为突变位点site1、site2、site3、site4。每个位点对应的突变引物分别是：site1A1B、site2A2B、site3A3B、site4A4B。每个引物的5’端含有一个属于Type IIs类限制性内切酶的Esp 3I位点。这些突变有的属于难度较大的突变类型，因此可以验证本研究所提供的方法的有效性。

表 1 实验所使用的突变引物序列Tab 1 Oligonucleotides used in the experiments

图 1 Esp 3I酶切位点及实验流程示意图Fig 1 The recognition sequence of Esp 3I and the schematic representation of the method

在这个实验中，如果引入3个位点的突变，则有4种组合，即123、124、234、134，而4个位点的突变只有一种，即1234。实验对所有这些组合进行了测试，它们分别被称为突变123、124、234、134、1234。实验分别利用两个邻近的位点引物做PCR扩增，对于需要引入3个位点的突变的情形，先扩增出3个片段，而对于需要引入4个位点突变的情形，共需要扩增出4个片段。然后，实验利用Esp 3I对其进行酶切，并借助连接反应将酶切后片段连接在一起，形成所需要的突变载体。实验利用基因测序的方法对所获得突变载体克隆进行了验证，如图3A所示，突变123、124、234、134、1234的成功率分别为：7/7（100%）、10/10（100%）、8/9（89%）、9/9（100%）、12/12（100%），成功率接近100%，说明方法的有效性。图3B中所示为四个突变位点突变后碱基，其中，突变位点site1为9 bp长度的置换突变，突变位点site2为一个氨基酸编码序列的改变，突变位点site3为13bp的序列删除，突变位点site4为单氨基酸编码转换。突变后序列在所设计引物中均有所体现，在表1中用黑体字标出。实验测序结果充分验证了方法的有效性。

图 2 nm23-EGFP融合基因序列中的突变位点Fig 2 Sequence of the nm23-EGFP fusion gene and the desired mutagenic sites

图 3 实验突变结果及测序图。A：突变1-2-3、1-2-4、2-3-4、1-3-4和1-2-3-4的突变成率；B：四个位点的突变测序图。Fig 3 Sequencing results of the mutants. A: mutational rate of the mutants; B: sequencing maps of the mutants.

3 讨论

体外基因定点突变技术，已经是分子生物学实验中的一个常用技术，但多数相关的实验方法，只适用于单一位点的序列突变，而对于在目标基因中的多个位点引入突变，实验程序则非常繁琐。本研究所提供的实验方法，是在既有的依赖Type IIs类的限制性内切酶的方法的基础上形成的。Ko等[6]报道了一个可用于多位点突变的方法，但这种方法需要凝胶电泳和DNA回收等步骤，很难在短时间内完成，因此并不适合做为一般的实验方法使用，尤其是那些需要对多个样品进行突变的情况。本研究所提供的方法中，则完全避免了凝胶电泳和DNA回收等步骤，实验程序简单，而且可在短时间内完成，也适用于同时处理多个样品的情况。在本研究提供的实验程序中，我们一般会在实验的前一天，做第一步的PCR反应，这样，在次日正式开始实验时，就可以进行后续的酶切和纯化步骤，后面的实验步骤就可以于一天内完成。为了验证实验程序的有效性，我们在nm23-EGFP融合基因中，分别引入了三个或者四个位点的突变，实验结果都获得了接近100%的突变率。本研究所提供的方法，为基因结构和功能的研究提供了一个有用的工具。