地塞米松对小鼠血细胞密度和肝肾组织结构的影响

唐超智+梁乐+刘杰+杨钧棠+王文晟+

摘要:选取20 g健康昆明小鼠14只,随机均分为对照组和处理组,连续21 d分别尾静脉注射生理盐水和0.01 mg/mL地塞米松稀释液,每天一次0.2 mL/次。于第22天对小鼠采血,分析其血细胞密度变化;并迅速处死小鼠,取肝和肾,10%福尔马林固定,石蜡切片、HE染色,显微镜下观察小鼠肝和肾的组织学变化。结果表明,与对照组相比,处理组小鼠血液中的白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)密度明显降低,肝小叶内和门管区有炎症细胞浸润,肝细胞界限不清,肝索排列松散,肝血窦扩张,肾组织结构无明显变化。说明地塞米松会下调小鼠外周血的免疫力,并对肝有一定的毒副作用。

关键词:地塞米松;小鼠;血细胞密度;肝;肾;组织结构

中图分类号:S859.7文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2607-04

Effects of Dexamethasone on Blood Cell Density and Tissue Structure

of mice Liver and Kidney

TANG Chao-zhi,LIANG Le,LIU Jie,YANG Jun-tang,WANG Wen-sheng

(College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China)

Abstract:Fourteen healthy Kunming mice weighing 20 g were selected and randomly divided into two groups on average and treated with physiological saline and 0.01 mg/mL dexamethasone diluted solution of 0.2 mL/t·d by tail vein injection for 21 days. At 22th day, the blood of all the mice was collected to analyze the density of blood cell. The livers and kidneys of rapidly killed mice were taken out and fixed in 10% formalin for paraffin sections and observation under microscope after stained by hematoxylin eosin. The results showed that compared with the control group, the density of white blood cell and lymphocyte in treated mice was decreased obviously. Inflammatory infiltration was observed frequently in hepatic lobules and portal area. The boundary of hepatocytes became indefinite. Hepatic cords were arranged loosely. Hepatic sinusoid was enlarged while the tissue structure of kidney showed no significant difference. It is indicated that Dexamethasone could downregulate the peripheral blood immunity and had certain side effects on the mice liver.

Key words: dexamethasone; mice; density of blood cell; liver; kidney; tissue structure

基金项目:国家自然科学基金项目(31170733);河南省特聘教授科研启动资助项目

早在1950年,人们就发现糖皮质激素对炎症性疾病具有较好的治疗效果[1]。1958年,人工合成的糖皮质激素药物——地塞米松应运而生。随着其使用范围的不断扩大,对地塞米松的浓度需求也在不断增高,1991年Mostafa等[2]检测发现一次性眼内注射地塞米松的剂量高达4.8 mg仍未引起机体出现明显的副反应,更使得地塞米松成为全球普及的常用药品,目前中国的地塞米松使用量已居世界之首。

随着糖皮质激素药物的广泛应用,近10年来,人们注意到长时间注射一些糖皮质激素类药物会引起一系列副反应,如导致糖尿病、消化道溃疡、骨质疏松症、库欣综合征、皮肤萎缩、精神错乱及青光眼等病症,并可能导致炎症患者产生糖皮质激素耐受性疾病(如糖皮质激素耐受性哮喘等)[3-6],但关于地塞米松副作用的研究并不深入,尤其是连续使用后是否会对机体产生毒性鲜有报道。本试验采用静脉注射、血液分析、组织切片和HE染色等方法,初步探讨了连续使用地塞米松对小鼠血液和肝、肾组织结构的影响。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1药品和试剂地塞米松注射液为天津药业集团新郑股份有限公司产品(1 mL地塞米松注射液含地塞米松5 mg,使用前以5%葡萄糖稀释,1 mL稀释液中含地塞米松0.01 mg),常规试剂由河南师范大学生命科学学院实验办公室采购提供。

1.1.2试验动物试验用昆明小鼠购于新乡医学院实验动物中心,在河南师范大学生命科学学院动物房饲养,自由获取水和食物,保持12 h/12 h的光暗周期。

1.2试验方法

选取体重20 g健康昆明小鼠14只,随机均分成对照组和处理组,连续21 d分别尾静脉注射生理盐水和0.01 mg/mL的地塞米松稀释液,每天一次0.2 mL/次。于给药的第22天,对全部小鼠摘眼球取血,全自动血液分析仪检测血细胞密度变化;同时快速处死小鼠,取肝和肾,4 ℃ 生理盐水浸洗,10%福尔马林固定,石蜡切片(厚6 μm),HE染色,光镜下观察肝和肾的组织结构变化。

1.3数据分析

所得数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析,Excel 2007作图。

2结果与分析

2.1血细胞密度变化

与对照组相比,地塞米松处理组小鼠白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)密度明显减小(图1),其中WBC的平均减少率为44.14%,LYM的平均减少率为40.51%。而红细胞(RBC)和血小板(PLT)密度无明显变化(图2)。

2.2肝组织结构变化

光镜观察发现,对照组肝组织(图3)的间质区不发达,肝小叶彼此相连,难以区分边界。肝细胞排成规则条索状,细胞间界限清晰;细胞质着均匀红色;细胞核大而圆,着深紫色,核内多见常染色质,常见双核细胞。肝索围绕中央静脉呈放射状整齐排列。肝索之间为狭窄的肝血窦。

处理组肝组织间质区扩张,肝小叶间分界明显(图4)。肝细胞排列成不规则条索状,细胞间界限不清晰;胞质着不均匀红色或浅红色;多数胞核的核膜下方可见着紫色的异染色质沉积,而核中央区着色较浅,部分细胞的核已消失,双核细胞极少,很显然肝细胞的正常功能活动减弱。中央静脉周围肝索排列不规则。肝血窦扩张。门管区和肝小叶内均见到明显的炎症细胞浸润(图5、图6)。

2.3肾组织结构变化

光镜下,对照组和处理组肾组织结构未见明显差异。

3讨论

3.1血细胞密度变化

本试验选定的地塞米松对小鼠的注射浓度为0.1 mg/kg,与目前的临床使用浓度一致,但连续注射21 d后发现,小鼠血液中白细胞和淋巴细胞密度的平均减少率可高达44.14%和40.51%。虽然Buttgereit等[7,8]已经指出,糖皮质激素类物质会减少外周血中部分白细胞和淋巴细胞的数量,但地塞米松作用下其减幅如此之大令人吃惊。血液中的白细胞和淋巴细胞是机体周围免疫系统的一部分,它们随血液循环流走全身,构成机体的重要保护屏障,地塞米松导致血液免疫细胞大幅减少,将会使机体的免疫防御能力下降,而导致感染几率上升。

外周血中,血细胞的密度由造血干细胞分化增殖的补偿量和血细胞转移或凋亡的损失量决定。地塞米松处理后,红细胞和血小板的密度没有明显变化,而免疫细胞的密度降幅较大,表明地塞米松不会影响红细胞系和巨核细胞系的分化,而很可能对粒细胞巨噬细胞系、单核细胞系和淋巴细胞系的分化有抑制作用,也或者会诱导血液免疫细胞凋亡或发生转移。

3.2肝组织结构变化

吕嵘等[9]研究表明,超生理剂量的地塞米松注射会导致家兔肝组织水肿、肝细胞空泡样坏死、肝各级静脉中红细胞淤积严重。本试验结果虽也观察到地塞米松导致肝细胞和组织损伤,但显然不如吕嵘等[9]观察到的兔肝损伤严重,这可能与地塞米松处理剂量的差异有关。而同样观察到了地塞米松导致肝损伤,表明肝可能是地塞米松毒副作用的主要靶器官。

关于药物性肝损伤的机理有多种说法。如Michael等[10]指出急性药物性肝损伤是药物本身直接对肝细胞产生毒性所致,慢性药物性肝损伤是先引起机体免疫细胞活动,进一步引起多种免疫分子活动,最后引起肝细胞和组织损伤。本试验未观察到严重的肝细胞坏死,却在肝内发现了明显的炎症浸润,表明地塞米松所致的肝损伤途径可能与Michael等[10]的免疫介导理论相似。但吕嵘等[9]依据Martfnez[11]的观点认为,地塞米松导致的兔肝损伤可能与机体内氧化还原系统动态平衡被打破有关,生理情况下,氧自由基(OFR)不断产生,也不断被抗氧化系统清除,不产生细胞损伤,但外源性药物在肝脏代谢过程中产生过多的OFR,超过抗氧化系统的清除能力,过多的OFR导致肝细胞内的脂类、核酸、蛋白和糖蛋白等发生氧化,最终导致肝细胞结构严重受损和功能丧失。

另外,本试验观察到地塞米松处理后小鼠肝内出现多处炎症浸润的现象也提示,地塞米松可能在肝内引发免疫应答,驱动血液免疫细胞向肝转移。这一推测与本试验血细胞检测结果相吻合,也与Dhabhar等[12]发现的糖皮质激素类物质能促使白细胞从血循环迁移到创伤局部的结果相一致,但进一步深入研究予以充分证实仍很有必要。

3.3肾组织结构变化

地塞米松处理后小鼠肾组织结构在显微水平未见明显变化,表明地塞米松不具有肾毒性或肾毒性很弱。

4结论与展望

4.1结论

本试验结果显示,21 d连续注射正常剂量的地塞米松后,小鼠血液免疫细胞密度明显下降,肝细胞和组织受损,肝内多处发生明显的炎症浸润。表明连续注射地塞米松会下调小鼠外周血的免疫力,并可能导致肝炎。

4.2展望

本试验结果表明,地塞米松对机体有一定毒副作用,有必要进一步深入研究以揭示其毒副作用的具体机制,临床使用地塞米松等糖皮质激素类药物须谨慎用药。另外,本研究发现地塞米松会导致正常肝组织发生明显的炎症浸润,可用以开发新的肝炎模型。

参考文献:

[1] OLSON J A, STEFFENSEN E H, MARGULIS R R, et al. Effect of ACTH on certain inflammatory diseases of the eye[J]. JAMA,1950, 142(16): 1276-1278.

[2] MOSTAFA N, GHOLAM A P, MAGDY E T, et al. Toxicity of high-dose intravitreal dexamethasone[J].Int Ophthalmol,1991, 15(4):233-235.

[3] SCHACKE H, DOCKE W D, ASADULLAH K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids[J].Pharmacol Ther,2002,96(1):23-43.

[4] ADCOCK I M, LANE S J. Corticosteroid-insensitive asthma: molecular mechanisms[J]. J Endocrinol,2003, 178(3): 347-355.

[5] WIKSTROM A C. Glucocorticoid action and novel mechanisms of steroid resistance: role of glucocorticoid receptor-interacting proteins for glucocorticoid responsiveness[J].J Endocrinol,2003, 178(3): 331-337.

[6] SCHACKE H, SCHOTTELIUS A, DOCKE W D, et al. Dissociation of transactivation from transrepression by a selective glucocorticoid receptor agonist leads to separation of therapeutic effects from side effects[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(1):227-232.

[7] BUTTGEREIT F, SAAG K G, CUTOLO M, et al. The molecular basis for the effectiveness, toxicity, and resistance to glucocorticoids: focus on the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Scand J Rheumatol,2005, 34(1): 14-21.

[8] BUTTGEREIT F, SCHEFFOLD A. Rapid glucocorticoid effects on immune cells[J]. Steroids,2002, 67(6): 529 -534.

[9] 吕 嵘,白卫兵,王生奎.地塞米松对兔肝脏组织形态结构的影响[J]. 动物医学进展,2010,31(2):56-59.

[10] MICHAEL P H, CYNTHIA J. Mechanisms of drug-induced liver injury[J]. AAPS J,2006,8(1):E48-54.

[11] MARTFNEZ-CAYUELA M. Oxygen free radicals and human disease[J]. Biochimie. 1995, 77(3): 147-161.

[12] DHABHAR F S, MILLER A H, MCEWEN B S. Stress-induced changes in blood leukocyte distribution: Role of adrenal steroid hormones[J]. J Immunol,1996,157(4):1638-1644.

2.3肾组织结构变化

光镜下,对照组和处理组肾组织结构未见明显差异。

3讨论

3.1血细胞密度变化

本试验选定的地塞米松对小鼠的注射浓度为0.1 mg/kg,与目前的临床使用浓度一致,但连续注射21 d后发现,小鼠血液中白细胞和淋巴细胞密度的平均减少率可高达44.14%和40.51%。虽然Buttgereit等[7,8]已经指出,糖皮质激素类物质会减少外周血中部分白细胞和淋巴细胞的数量,但地塞米松作用下其减幅如此之大令人吃惊。血液中的白细胞和淋巴细胞是机体周围免疫系统的一部分,它们随血液循环流走全身,构成机体的重要保护屏障,地塞米松导致血液免疫细胞大幅减少,将会使机体的免疫防御能力下降,而导致感染几率上升。

外周血中,血细胞的密度由造血干细胞分化增殖的补偿量和血细胞转移或凋亡的损失量决定。地塞米松处理后,红细胞和血小板的密度没有明显变化,而免疫细胞的密度降幅较大,表明地塞米松不会影响红细胞系和巨核细胞系的分化,而很可能对粒细胞巨噬细胞系、单核细胞系和淋巴细胞系的分化有抑制作用,也或者会诱导血液免疫细胞凋亡或发生转移。

3.2肝组织结构变化

吕嵘等[9]研究表明,超生理剂量的地塞米松注射会导致家兔肝组织水肿、肝细胞空泡样坏死、肝各级静脉中红细胞淤积严重。本试验结果虽也观察到地塞米松导致肝细胞和组织损伤,但显然不如吕嵘等[9]观察到的兔肝损伤严重,这可能与地塞米松处理剂量的差异有关。而同样观察到了地塞米松导致肝损伤,表明肝可能是地塞米松毒副作用的主要靶器官。

关于药物性肝损伤的机理有多种说法。如Michael等[10]指出急性药物性肝损伤是药物本身直接对肝细胞产生毒性所致,慢性药物性肝损伤是先引起机体免疫细胞活动,进一步引起多种免疫分子活动,最后引起肝细胞和组织损伤。本试验未观察到严重的肝细胞坏死,却在肝内发现了明显的炎症浸润,表明地塞米松所致的肝损伤途径可能与Michael等[10]的免疫介导理论相似。但吕嵘等[9]依据Martfnez[11]的观点认为,地塞米松导致的兔肝损伤可能与机体内氧化还原系统动态平衡被打破有关,生理情况下,氧自由基(OFR)不断产生,也不断被抗氧化系统清除,不产生细胞损伤,但外源性药物在肝脏代谢过程中产生过多的OFR,超过抗氧化系统的清除能力,过多的OFR导致肝细胞内的脂类、核酸、蛋白和糖蛋白等发生氧化,最终导致肝细胞结构严重受损和功能丧失。

另外,本试验观察到地塞米松处理后小鼠肝内出现多处炎症浸润的现象也提示,地塞米松可能在肝内引发免疫应答,驱动血液免疫细胞向肝转移。这一推测与本试验血细胞检测结果相吻合,也与Dhabhar等[12]发现的糖皮质激素类物质能促使白细胞从血循环迁移到创伤局部的结果相一致,但进一步深入研究予以充分证实仍很有必要。

3.3肾组织结构变化

地塞米松处理后小鼠肾组织结构在显微水平未见明显变化,表明地塞米松不具有肾毒性或肾毒性很弱。

4结论与展望

4.1结论

本试验结果显示,21 d连续注射正常剂量的地塞米松后,小鼠血液免疫细胞密度明显下降,肝细胞和组织受损,肝内多处发生明显的炎症浸润。表明连续注射地塞米松会下调小鼠外周血的免疫力,并可能导致肝炎。

4.2展望

本试验结果表明,地塞米松对机体有一定毒副作用,有必要进一步深入研究以揭示其毒副作用的具体机制,临床使用地塞米松等糖皮质激素类药物须谨慎用药。另外,本研究发现地塞米松会导致正常肝组织发生明显的炎症浸润,可用以开发新的肝炎模型。

参考文献:

[1] OLSON J A, STEFFENSEN E H, MARGULIS R R, et al. Effect of ACTH on certain inflammatory diseases of the eye[J]. JAMA,1950, 142(16): 1276-1278.

[2] MOSTAFA N, GHOLAM A P, MAGDY E T, et al. Toxicity of high-dose intravitreal dexamethasone[J].Int Ophthalmol,1991, 15(4):233-235.

[3] SCHACKE H, DOCKE W D, ASADULLAH K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids[J].Pharmacol Ther,2002,96(1):23-43.

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[5] WIKSTROM A C. Glucocorticoid action and novel mechanisms of steroid resistance: role of glucocorticoid receptor-interacting proteins for glucocorticoid responsiveness[J].J Endocrinol,2003, 178(3): 331-337.

[6] SCHACKE H, SCHOTTELIUS A, DOCKE W D, et al. Dissociation of transactivation from transrepression by a selective glucocorticoid receptor agonist leads to separation of therapeutic effects from side effects[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(1):227-232.

[7] BUTTGEREIT F, SAAG K G, CUTOLO M, et al. The molecular basis for the effectiveness, toxicity, and resistance to glucocorticoids: focus on the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Scand J Rheumatol,2005, 34(1): 14-21.

[8] BUTTGEREIT F, SCHEFFOLD A. Rapid glucocorticoid effects on immune cells[J]. Steroids,2002, 67(6): 529 -534.

[9] 吕 嵘,白卫兵,王生奎.地塞米松对兔肝脏组织形态结构的影响[J]. 动物医学进展,2010,31(2):56-59.

[10] MICHAEL P H, CYNTHIA J. Mechanisms of drug-induced liver injury[J]. AAPS J,2006,8(1):E48-54.

[11] MARTFNEZ-CAYUELA M. Oxygen free radicals and human disease[J]. Biochimie. 1995, 77(3): 147-161.

[12] DHABHAR F S, MILLER A H, MCEWEN B S. Stress-induced changes in blood leukocyte distribution: Role of adrenal steroid hormones[J]. J Immunol,1996,157(4):1638-1644.

2.3肾组织结构变化

光镜下,对照组和处理组肾组织结构未见明显差异。

3讨论

3.1血细胞密度变化

本试验选定的地塞米松对小鼠的注射浓度为0.1 mg/kg,与目前的临床使用浓度一致,但连续注射21 d后发现,小鼠血液中白细胞和淋巴细胞密度的平均减少率可高达44.14%和40.51%。虽然Buttgereit等[7,8]已经指出,糖皮质激素类物质会减少外周血中部分白细胞和淋巴细胞的数量,但地塞米松作用下其减幅如此之大令人吃惊。血液中的白细胞和淋巴细胞是机体周围免疫系统的一部分,它们随血液循环流走全身,构成机体的重要保护屏障,地塞米松导致血液免疫细胞大幅减少,将会使机体的免疫防御能力下降,而导致感染几率上升。

外周血中,血细胞的密度由造血干细胞分化增殖的补偿量和血细胞转移或凋亡的损失量决定。地塞米松处理后,红细胞和血小板的密度没有明显变化,而免疫细胞的密度降幅较大,表明地塞米松不会影响红细胞系和巨核细胞系的分化,而很可能对粒细胞巨噬细胞系、单核细胞系和淋巴细胞系的分化有抑制作用,也或者会诱导血液免疫细胞凋亡或发生转移。

3.2肝组织结构变化

吕嵘等[9]研究表明,超生理剂量的地塞米松注射会导致家兔肝组织水肿、肝细胞空泡样坏死、肝各级静脉中红细胞淤积严重。本试验结果虽也观察到地塞米松导致肝细胞和组织损伤,但显然不如吕嵘等[9]观察到的兔肝损伤严重,这可能与地塞米松处理剂量的差异有关。而同样观察到了地塞米松导致肝损伤,表明肝可能是地塞米松毒副作用的主要靶器官。

关于药物性肝损伤的机理有多种说法。如Michael等[10]指出急性药物性肝损伤是药物本身直接对肝细胞产生毒性所致,慢性药物性肝损伤是先引起机体免疫细胞活动,进一步引起多种免疫分子活动,最后引起肝细胞和组织损伤。本试验未观察到严重的肝细胞坏死,却在肝内发现了明显的炎症浸润,表明地塞米松所致的肝损伤途径可能与Michael等[10]的免疫介导理论相似。但吕嵘等[9]依据Martfnez[11]的观点认为,地塞米松导致的兔肝损伤可能与机体内氧化还原系统动态平衡被打破有关,生理情况下,氧自由基(OFR)不断产生,也不断被抗氧化系统清除,不产生细胞损伤,但外源性药物在肝脏代谢过程中产生过多的OFR,超过抗氧化系统的清除能力,过多的OFR导致肝细胞内的脂类、核酸、蛋白和糖蛋白等发生氧化,最终导致肝细胞结构严重受损和功能丧失。

另外,本试验观察到地塞米松处理后小鼠肝内出现多处炎症浸润的现象也提示,地塞米松可能在肝内引发免疫应答,驱动血液免疫细胞向肝转移。这一推测与本试验血细胞检测结果相吻合,也与Dhabhar等[12]发现的糖皮质激素类物质能促使白细胞从血循环迁移到创伤局部的结果相一致,但进一步深入研究予以充分证实仍很有必要。

3.3肾组织结构变化

地塞米松处理后小鼠肾组织结构在显微水平未见明显变化,表明地塞米松不具有肾毒性或肾毒性很弱。

4结论与展望

4.1结论

本试验结果显示,21 d连续注射正常剂量的地塞米松后,小鼠血液免疫细胞密度明显下降,肝细胞和组织受损,肝内多处发生明显的炎症浸润。表明连续注射地塞米松会下调小鼠外周血的免疫力,并可能导致肝炎。

4.2展望

本试验结果表明,地塞米松对机体有一定毒副作用,有必要进一步深入研究以揭示其毒副作用的具体机制,临床使用地塞米松等糖皮质激素类药物须谨慎用药。另外,本研究发现地塞米松会导致正常肝组织发生明显的炎症浸润,可用以开发新的肝炎模型。

参考文献:

[1] OLSON J A, STEFFENSEN E H, MARGULIS R R, et al. Effect of ACTH on certain inflammatory diseases of the eye[J]. JAMA,1950, 142(16): 1276-1278.

[2] MOSTAFA N, GHOLAM A P, MAGDY E T, et al. Toxicity of high-dose intravitreal dexamethasone[J].Int Ophthalmol,1991, 15(4):233-235.

[3] SCHACKE H, DOCKE W D, ASADULLAH K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids[J].Pharmacol Ther,2002,96(1):23-43.

[4] ADCOCK I M, LANE S J. Corticosteroid-insensitive asthma: molecular mechanisms[J]. J Endocrinol,2003, 178(3): 347-355.

[5] WIKSTROM A C. Glucocorticoid action and novel mechanisms of steroid resistance: role of glucocorticoid receptor-interacting proteins for glucocorticoid responsiveness[J].J Endocrinol,2003, 178(3): 331-337.

[6] SCHACKE H, SCHOTTELIUS A, DOCKE W D, et al. Dissociation of transactivation from transrepression by a selective glucocorticoid receptor agonist leads to separation of therapeutic effects from side effects[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(1):227-232.

[7] BUTTGEREIT F, SAAG K G, CUTOLO M, et al. The molecular basis for the effectiveness, toxicity, and resistance to glucocorticoids: focus on the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Scand J Rheumatol,2005, 34(1): 14-21.

[8] BUTTGEREIT F, SCHEFFOLD A. Rapid glucocorticoid effects on immune cells[J]. Steroids,2002, 67(6): 529 -534.

[9] 吕 嵘,白卫兵,王生奎.地塞米松对兔肝脏组织形态结构的影响[J]. 动物医学进展,2010,31(2):56-59.

[10] MICHAEL P H, CYNTHIA J. Mechanisms of drug-induced liver injury[J]. AAPS J,2006,8(1):E48-54.

[11] MARTFNEZ-CAYUELA M. Oxygen free radicals and human disease[J]. Biochimie. 1995, 77(3): 147-161.

[12] DHABHAR F S, MILLER A H, MCEWEN B S. Stress-induced changes in blood leukocyte distribution: Role of adrenal steroid hormones[J]. J Immunol,1996,157(4):1638-1644.