MiR-503逆转肺癌耐药细胞株A549/DDP的耐药性及其机制研究

武毅 郭丽丽 刘京豪 刘仁旺 刘明辉 陈军

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年肺癌造成大约560,000死亡，其中一半来自中国[1]。由于起病隐匿，早期少有症状或症状不明显，大多数肺癌患者在确诊时往往已到了晚期。近年来，由于治疗方案的不断优化，以及靶向药物的投入使用，肺癌的治疗现状已经得到了明显的改善，但仍然存在一些急需解决的问题，例如肿瘤细胞对药物的耐受性[2]。顺铂通过靶向DNA和拓扑异构酶II（Topo II），抑制DNA的合成和转录，诱导细胞凋亡，最终阻止肿瘤细胞生长[3]。在临床运用过程中，肺癌细胞往往发展出对顺铂的耐药性，使得药效明显下降。因此，探讨肿瘤细胞的耐药机制，开发新的逆转耐药性的方法，对提高临床患者的受益有十分重要的意义。已有的研究[4-7]发现，肿瘤细胞产生耐药的机制包括减少药物的吸收，通过ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白增加药物的外排，通过谷胱甘肽系统增加对抗肿瘤药物的解毒作用，凋亡途径异常减少肿瘤细胞的凋亡[4-7]。

MiRNAs是一类内源性的不编码蛋白的小RNAs，长度一般为18个-24个核苷酸，可通过与目标mRNA的互补序列相结合，在后转录水平对基因的表达进行调控，导致目标mRNA的降解或者基因沉默[8]。很多研究[9,10]已经提供了特异性miRNAs的表达与肿瘤密切相关的证据，这些研究清楚的展现出一个单独的miRNA可通过其调控的目标基因，对多种与肿瘤细胞失控生长、抗凋亡、迁移和侵袭，甚至是肿瘤细胞对药物治疗的应答产生调控作用。

最近，miRNA-503（miR-503）在癌症中的作用备受关注。研究发现miR-503在口腔癌和肝细胞癌中的表达下调[11,12]，但在甲状旁腺癌和肾上腺皮质癌中却过表达[13,14]。并且，在肾上腺癌中，miR-503上调与患者的总体生存期缩短有关[13]。在肝癌细胞系HCCLM3中，miR-503则可诱导细胞停滞于G1期并抑制细胞的迁移和侵袭[11]。然而，miR-503在肺癌耐药性中的作用尚无太多的研究。

在本研究中，我们发现miR-503的高表达可以逆转A549/DDP的耐药性，抑制该细胞的生长并促进其凋亡。我们的结果说明miR-503在肺癌顺铂耐药中发挥重要作用，其机制可能是通过调控多种与耐药相关蛋白，细胞增殖相关蛋白和凋亡相关蛋白等有关。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 人肺癌细胞系A549和A549/DDP购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；细胞培养基购自Gibco；可稳定表达miR-503的miR-503 precursor质粒（pre-miR-503）及其阴性对照质粒购自Invitrogen；TaqMan MicroRNA assay kit购自Applied Biosystems；Lipofectamine 2000购自Gibco；MTS、Rh-123、RT-PCR试剂盒，pGL4.74[hRluc/TK]质粒，pGL4.32(luc2P/NF-κBRE/Hygro)质粒，pGL 4.44[luc2P/AP1 RE/Hygro]和Dual-GloTM Luciferase assay system均购自Promega公司；细胞凋亡流式检测试剂盒购自BD biosciences；单克隆抗体购自Santa Cruz公司；ECL免疫印迹底物试剂盒购自Millipore；顺铂购自Sigma公司；流式细胞仪：BD公司，酶标仪：Thermo，PCR仪：Thermo。

1.2 细胞培养与miR-503转染 A549和A549/DDP细胞培养于10 cm培养皿，37oC、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，培养基为90% EMEM，10%胎牛血清。0.25%胰酶-EDTA消化传代，所有试验均采用对数生长期细胞。将A549/DDP细胞暴露于底剂量［1/10的半数抑制浓度（50%concentration of inhibition, IC50）］的顺铂中维持细胞耐药性。

A549/DDP培养于10 cm培养皿中，待其达到约80%融合时，按照试剂盒说明书的操作方法，加入100 nmol/L pre-miR-503质粒或者阴性对照质粒进行转染，继续培养48 h。传代培养后，取细胞裂解后，用TaqMan MicroRNA assay kit进行Q-PCR实验，定量检测miR-503，以评估premiR-503的转染效果。

1.3 MTS法检测miR-503对细胞耐药性的作用 取对数生长期的细胞，以2×104/mL接种到96孔微孔板中，100 μL/孔，培养过夜使细胞贴壁。向对应试验孔加入不同浓度的顺铂，继续培养72 h，吸去培养基，加入100 μL含0.5 mg/mL MTS的RPMI-1640，继续培养4 h。最后用酶标仪测定490 nm波长下的光密度（optical density, OD）值，并计算药物对细胞的抑制率。抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以顺铂浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图并拟合抑制曲线，求得IC50值。逆转倍数（reversal fold, RF）= IC50（无miR-503）/IC50（有miR-503）。

1.4 流式细胞术检测A549/DDP细胞内Rh-123含量及细胞凋亡 取对数生长期的经pre-miR-503质粒转染的A549/DDP细胞，加入10 μmol/L Rh-123染液，培养1 h后收集细胞，调整细胞浓度至106/mL，用流式细胞仪检测细胞中Rh-123的荧光强度（488 nm激发光，560 nm发射光），以此检测细胞中Rh-123的含量。细胞凋亡采用PI/Annexin V-FITC双染法，均根据试剂盒说明书操作。以阴性对照质粒转染的肿瘤细胞作为对照。

1.5 Western blot法检测A549/DDP细胞中多种蛋白的表达取对数生长期的经pre-miR-503转染的A549/DDP细胞，收集细胞裂解提取蛋白。BCA法测定细胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白质以12% SDS-PAGE法分离并转移至PVDF膜上，以单克隆抗体4oC过夜孵育以检测目标蛋白。洗去一抗，以HRP连接的二抗于室温孵育2 h，洗涤后以ECL试剂盒显示免疫印迹条带。α-tubulin作为内参。

1.6 Real-time PCR检测A549/DDP肿瘤细胞中多种蛋白基因的mRNA水平 取对数生长期的经pre-miR-503转染的A549/DDP细胞，用Trizol法提取各组总RNA，用Real-time PCR试剂盒进行逆转录得到cDNA。MDR1上游引物序列：5'-AAAAAGATCAACTCGTACCACTC-3'，下游引物序列：5'-GCACAAAATACACCAACAA-3'；MRP1上游引物序列5′-ACTTCCACATCTGCTTCGTCAGT-3，下游引物序列：5′-ATTCAGCCACAGGAGGTAGAGAGC-3′；ERCC1上游引物序列：5′-GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3′，下游引物序列：5′-GCGGAGGCT-GAGGAACAG -3′；RhoE上游引物序列：5′-CCTCCACGTTGATTCGACTGTT-3′，下游引物序列：5′-TGTAAAAGCCG-TACGTTGCGGT-3′；Survivin上游引物序列：5′-GCATGGGTGCCCCGACGTT G-3′，下游引物序列： 5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′；Bcl-2上游引物序列：5′-ACGGGGTGAACTG GGGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-TGTTTGGGG CAGGCATGTTGACTT-3′；β-actin上游引物序列：5′-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3′，下游引物序列：5′-TC CTTAATGTCACGCACGATTT-3′；94oC变性3 min后，按下述条件扩增36个循环：95oC 15 s，65oC 30 s，72oC 95 s，72oC延伸5 min。

1.7 数据统计 实验数据以Mean±SD表示，使用SPSS 13.0软件进行分析。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建miR-503高表达的A549/DDP 如图1所示，与对照组（A549/DDP细胞中转染空载质粒）和未处理的原发A549/DDP细胞相比较，pre-miR-503转染的A549/DDP细胞中，miR-503的表达水平明显上升，这一结果说明miR-503高表达的A549/DDP构建成功。

图 1 MiR-503在人肺癌细胞系中的表达。在A549/DDP细胞中转染premiR-503质粒48 h后，利用TaqMan MicroRNA分析试剂盒，通过Q-PCR检测miR-503的表达水平。未处理组：A549/DDP细胞；对照组：转染空白对照质粒的A549/DDP细胞；miR-503组：转染pre-miR-503质粒的A549/DDP细胞。实验数据以均数±标准差表示，n=10，*表示与对照组相比，P＜0.05。Fig 1 The expression of miR-503 in human lung cancer cell lines. After transfection pre-miR-503 plasmids into A549/DDP cells for 48 h, the expression of miR-503 was detected by Q-PCR using TaqMan MicroRNA assay kit. Untreated group: the primary A549/DDP cells; Control group:A549/DDP cells transfected with control blank vector; miR-503 group:A549/DDP cell transfected with pre-miR-503 plasmids. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05).

2.2 转染miR-503可逆转A549/DDP的耐药性，提高胞内Rh-123浓度，促进细胞凋亡 实验结果显示，与对照组相比较，pre-miR-503转染的细胞对顺铂的敏感性明显增加，pre-miR-503组IC50为17.6 μM，其逆转系数是对照组（IC50为43.7 μM）的2.48倍；进一步研究发现miR-503转染组细胞吸收荧光染料Rh-123的能力较对照组提高了2.49倍，细胞凋亡率是对照组的10.3倍 (图2)。而且这些变化均与miR-503转染构成量效关系。

图 2 A549/DDP细胞中miR-503对药物敏感性，Rh-123的胞内浓度及细胞凋亡的作用。A：MTS法结果显示与对照组相比，转染pre-miR-503后，细胞对顺铂的敏感性明显增加，数据以Mean±SD表示，n=10，*表示与对照组相比，P＜0.05；B：流式细胞术结果表明与对照组相比，转染pre-miR-503后，细胞内Rh-123的浓度增加，数据以Mean±SD表示，n=10，*表示与对照组相比，P＜0.05；C：流式细胞术结果表明与对照组相比，转染pre-miR-503后，细胞凋亡数目增加，数据以Mean±SD表示，n=10，*表示与对照组相比，P＜0.05。Fig 2 The effect of miR-503 on drug sensitivity, intracellular level of Rh-123 and apoptosis in A549/DDP cells. A: The MTS assay indicated that the DDP-sensitivity in pre-miR-503 group was significantly increased while compared to the control group. Data was represented as Mean±SD, n=10,bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05); B: The flow cytometry assay results showed that there was an increased intracellular level of Rh-123 in pre-miR-503 group compared with control group. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05); C: The flow cytometry assay results showed that there was an increased apoptosis in pre-miR-503 group compared with control group. Data was represented as Mean±SD, n=10, bars indicate SD, *compared to the control group (P＜0.05).

2.3 MiR-503下调MDR1、MRP1、ERCC1、Survivin和Bcl-2的表达，上调RhoE的表达 为了进一步探讨miR-503逆转A549/DDP耐药性，促进肿瘤细胞凋亡的可能分子机制，我们分析了多种与耐药相关基因的表达变化情况。Western blot检测结果显示，与对照组相比较，premiR-503转染组细胞中MDR1和MRP1这两个多药耐药基因和与DNA损伤修复相关基因ERCC1的蛋白的表达水平均明显下调。此外，与肿瘤凋亡抑制相关的Survivin和Bcl-2的蛋白表达亦同时明显下调。有趣的是，miR-503上调了RhoE蛋白的表达水平（图3）。进一步应用RT-PCR检测显示，在pre-miR-503转染组细胞中，MDR1、MRP1、ERCCI、Survivin和Bcl-2等基因的mRNA表达水平明显下调，仅分别是对照组的18.5%、22.3%、18.6%、42.8%和68.1%（P＜0.05），而RhoE mRNA表达则是对照组的206.5%，明显升高（P＜0.05）。这些结果表明miR-503对上述基因表达的调控是通过转录水平实现的。

2.4 MiR-503抑制Akt的磷酸化 为了研究miR-503逆转A549/DDP耐药性的分子机制，我们重点研究了PI3K/Ak通路。Western blot显示，pre-miR-503转染后，Akt的磷酸化水平下降，说明PI3K/Akt信号通路受抑制（图4）。

3 讨论

肿瘤细胞增加药物的外排，减少药物的吸收是其耐受化疗药物的一种主要手段。ABC家族的跨膜转运蛋白，例如MDR1和MRP1，可将药物从细胞内测泵到外侧，在耐药的肿瘤细胞中经常过表达[15]。Pre-miR-503转染后，流式细胞术检测可见细胞内Rhodamin-123的含量升高，间接说明miR-503逆转A549/DDP的耐药性与减少药物的外排有关。进一步的研究发现，miR-503下调了MDR1和MRP1蛋白水平与mRNA水平的表达，为上述假设提供了佐证。

图 3 A549/DDP细胞中转染pre-miR-503后，耐药相关基因的蛋白表达水平。Western blot结果显示，与对照组相比，MDR1、MRP1、ERCC1、Survivin和Bcl-2的蛋白水平明显降低，而RhoE的蛋白水平明显增加，α-tubulin为内参。Fig 3 The expression of different drug-resistance related genes in A549/DDP cells transfected with pre-miR-503. Compared to the control group, the expression of MDR1,MRP1, ERCC1, Survivin and Bcl-2 were dramatically down-regulated while the expression of RhoE was significantly up-regulated in pre-miR-503 group by western blot assay. α-tubulin was used as an internal control.

图 4 MiR-503对Akt磷酸化水平的影响。Western blot结果显示，与对照组相比，转染pre-miR-503质粒后，Akt磷酸化水平降低，α-tubulin为内参。Fig 4 The effect of miR-503 on phosphorylation of Akt in human lung cancer cell lines.Western blot assay showed that the phosphorylation of Akt was downregulated in premiR-503 group compared with control group. α-tubulin was used as an internal control.

除了MDR1和MRP1，其他分子也可能参与肿瘤细胞耐受顺铂有关。ERCC1可以修复化疗药物造成的DNA损坏[16-18]，因此它的表达水平很可能与A549/DDP的耐药性有关。Western blot显示，A549/DDP细胞中ERCC1具有较高的表达，而pre-miR-503处理后其表达水平明显下降，并且这种下降与mRNA的下调有关。RhoE是一个非典型的RhoGTPase家族成员，它一直处于活化的GTP结合状态，最近发现其在一些主要的肺癌细胞系和癌组织中的表达下调，可促进肿瘤细胞的侵袭和转移[19]。在本研究中，miR-503可上调RhoE的表达水平，可能对肿瘤起到抑制的作用。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织中，它可抑制肿瘤细胞的凋亡，促进增殖和血管新生，因此被认为是一个具有很高价值的肿瘤治疗靶点[20,21]。实验结果显示，miR-503可下调Survivin表达，这与miR-503增加肿瘤细胞的凋亡率相匹配。Bcl-2是一个在细胞凋亡中发挥重要作用的蛋白，可抑制肿瘤细胞的凋亡，在很多肿瘤中发现Bcl-2的高表达与肿瘤的耐药密切相关[22,23]。已有研究[24]显示，在非小细胞耐顺铂细胞系A549/CDDP中，miR-503可以下调Bcl-2的表达，逆转肿瘤的耐药性。本研究发现，在A549/DDP细胞中，Bcl-2的蛋白表达水平明显升高，说明Bcl-2介导的抗凋亡是肿瘤产生耐药的主要机制之一。而premiR-503转染可使A549/DDP细胞Bcl-2的表达明显下降，这与流式观察到的细胞凋亡率上升一致，是miR-503逆转肿瘤耐药性的重要机制之一。

本研究发现，miR-503对细胞耐药性逆转起着重要调节作用的信号通路是PI3K/Akt[25-27]，miR-503可抑制Akt的磷酸化，抑制PI3K/Akt信号通路的活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖，逆转其抗药性，虽然具体的机制有待进一步的研究，但这种负调控可能是miR-503逆转A549/DDP耐药性的手段之一。