利用高效液相色谱法同时测定土曲霉发酵液中衣康酸及残糖

刘 兰，黄筱萍，熊大维，黄国昌，张 婷

(江西省科学院微生物研究所，330096，南昌)

利用高效液相色谱法同时测定土曲霉发酵液中衣康酸及残糖

刘 兰，黄筱萍，熊大维，黄国昌，张 婷

(江西省科学院微生物研究所，330096，南昌)

建立了高效液相色谱(HPLC)快速测定土曲霉发酵液中衣康酸及残糖的分析方法。使用TOSOH Tskgel oApak-A色谱柱，以0.75 mmol/L H2SO4为流动相，在柱温45 ℃，流速1.0 mL/min的条件下，采用示差折光检测器进行检测。结果表明，该方法在20 min内可实现发酵液中衣康酸和葡萄糖的完全分离与定量。衣康酸在0～10.056 g/L范围内的线性关系良好，相关系数为0.999 9，相对标准偏差(n=6)为0.33%，加标回收率100.88%～102.74%。葡萄糖在0～6.016 g/L范围内的线性关系良好，相关系数为0.999 9，相对标准偏差(n=6)为0.12%，加标回收率101.26%～103.12%。该法适用于土黄霉发酵液中衣康酸和葡萄糖的快速、高效分离和定量测定。

高效液相色谱；衣康酸；葡萄糖；土曲霉；发酵液

0 引言

衣康酸(Itaconic acid)学名亚甲基丁二酸、甲叉丁二酸、亚甲基琥珀酸[1]，是世界上5大有机酸之一。由于其含不饱和双键，具有活泼的化学性质，能进行各种加成反应，酯化反应和聚合反应，是化学合成和化工生产的重要工业原料，在化纤、合成树脂、塑料、橡胶、医药、表面活性剂以及食品领域具有广泛的应用，随着衣康酸具有的独特性能被认识及应用范围的迅速扩大，衣康酸的生产技术也在不断进步[2]。

发酵法生产衣康酸由于原料易得，工艺技术成熟，是目前国内外工业生产一致采用的方法[4]。测定衣康酸发酵液中残糖及衣康酸的变化，对揭示代谢途径以及控制发酵过程，从而优化发酵工艺条件意义重大。目前，衣康酸发酵液中的衣康酸采用Friedkin碘量法测定，还原糖采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸比色法)或菲林试剂滴定法测定[3-5]。由于采用多种分析手段分析发酵液，过程繁琐费时。因此针对衣康酸发酵工艺建立快速、准确地同时测定衣康酸和残糖的分析方法对于衣康酸发酵技术的发展具有重要的意义。白冬梅等使用反相高效液相色谱法同时分析了发酵液中有机酸和葡萄糖[6-7]。马瑞等使用离子排斥液相色谱法同时分析了6种有机酸和3种糖类物质[8]。

本研究采用HPLC法，利用TOSOH Tskgel oApak-A色谱柱，以示差折光检测器(RID)检测，建立了同时检测土曲霉发酵液中葡萄糖和衣康酸的方法。该方法可以较准确地测定衣康酸发酵过程中糖的消耗量及衣康酸代谢产物的生成量，这对于控制发酵过程，优化发酵工艺条件及操作参数，从而提高衣康酸产量具有重要的理论和现实指导意义。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

日本岛津(Shimadzu)LC-20A高效液相色谱仪(配示差折光检测器，岛津LC电脑工作站)；Practum224-1CN电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；FDY0501-UV-P超纯水设备(青岛富勒科技有限公司)；H2500R-2高速冷冻离心机(湖南湘仪)。

衣康酸(纯度为99%；CAS号97-65-4)；葡萄糖(纯度为99.5%；CAS号：55-99-7)。

1.2色谱条件

色谱柱：TOSOH Tskgel oApak-A(300 mm×7.8mm，5 μm)；流动相：0.75 mmol/L H2SO4；流速：1.0 mL/min；柱温：45 ℃；检测器：RID；进样量：10 μL；外标法定量。

1.3样品溶液配制

1.3.1 标准溶液配制 准确称取烘干至恒重的分析纯葡萄糖5.013 4 g，用超纯水溶解，定容至100 mL，配成50.13 4 g/L的标准溶液，作为储备液。然后分别从储备液中精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL至50 mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.002 7 g/L、2.005 4 g/L、3.008 0 g/L、4.010 7 g/L、5.013 4 g/L、6.016 1 g/L的标准工作溶液。

准确称取衣康酸标准品2.031 5 g(纯度为99%)，用超纯水溶解，定容至100 mL，配成20.112 g/L的标准溶液，作为储备液。然后分别从储备液中精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL至10 mL容量瓶中, 加超纯水定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为2.0112 g/L、4.022 4 g/L、6.033 6 g/L、8.044 8 g/L、10.056 0 g/L的标准工作溶液。

1.3.2 混合标准溶液配制 称取衣康酸0.710 6 g及葡萄糖0.505 9 g，用超纯水溶解至100 mL，配制含衣康酸和葡萄糖标准物质的混合溶液，2组份的质量浓度见表1。

表1 衣康酸及葡萄糖混合标准溶液的组成

1.4定性和定量

在相同色谱条件下，将样品色谱图与衣康酸以及葡萄糖标准液色谱图对照，根据保留时间确定样品中各组分的色谱峰；在标样与样品进样量相同的情况下，应用外标法定量，计算样品中各组分的含量。

2 结果与讨论

2.1标准物质的确定

在1.2节的色谱条件下分别测定衣康酸和葡萄糖标准溶液，确定各组分的保留时间(衣康酸的色谱图见图1；葡萄糖的色谱图见图2)；再测定混合标准溶液，得到混合标准溶液的色谱图(见图3)，从图3可以看出衣康酸和葡萄糖的分离效果很好，出峰顺序为葡萄糖、衣康酸。

图1 衣康酸标准溶液色谱图

图2 葡萄糖标准溶液色谱图

图3 葡萄糖和衣康酸混合标准溶液色谱图

2.2色谱条件的选择

本实验根据色谱柱的特性对分析温度及流速进行了考察，确定最佳分析条件。

2.2.1 柱温的选择 分别考察了柱温为35 ℃、40 ℃、45 ℃时的分离情况，从图4中可看出柱温对葡萄糖和衣康酸的分离度影响不大，衣康酸保留时间稍提前，且柱压降低。考虑柱压低可延长分析柱的的寿命，本实验将柱温定为45 ℃。

2.2.2 流速的选择 流动相的流速对液相色谱的分离有影响，流速分别设定为0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，进行考察。从图4中可看出，随着流速的增加，保留时间都有提前，但柱压增大，峰面积减小，说明灵敏度下降，综合考虑，本实验选择流速为1.0 mL/min。

图4 柱温及流速对葡萄糖和衣康酸混合溶液保留时间的影响

2.3标准工作曲线的制作

将1.3.1配制的葡萄糖及衣康酸标准工作溶液，按10 μL进样量分别进行分析，记录各质量浓度得到的峰面积A，将各峰面积A与对应的质量浓度C(g/L)进行线性回归，结果见表2。

表2 衣康酸和葡萄糖的保留时间、线性关系

2.4重复性(精密度)和回收率(准确度)

2.4.1 重复性(精密度)实验 将摇瓶发酵一定时间的发酵液进行适当稀释，作为试验样品，按色谱条件，进样分析得色谱图5，可见葡萄糖出峰时间9.130 min，衣康酸出峰时间18.332 min，两者分离效果好，其它杂质低。连续进样6次，测得结果见表3，葡萄糖和衣康酸的相对标准偏差为0.11%、0.33%。

图5 土曲霉摇瓶发酵液色谱图

表3 土曲霉发酵液的重复性试验结果

2.4.2 加标回收率(准确度)实验 加标回收率的测定，是对所建立分析方法适用性及系统误差的检验，也是分析质量控制的一种手段。本实验以稀释一定倍数的发酵液作为试验样品，平行取样6次进行2个水平的加标回收试验，结果见表4，得到葡萄糖和衣康酸的加标回收率在100.88%～103.12%之间。

表4土曲霉发酵液中葡萄糖和衣康酸的加标回收率(n=6)

CompoundBackground/g·L-1Added/g·L-1Found/g·L-1Recovery/%Glucose2．46711．50513．01024．09615．5463103．12101．26Itaconicacid3．0643．01686．03366．24769．1778102．74100．88

3 结论

1)采用HPLC对土曲霉发酵液中衣康酸及葡萄糖含量进行检测，确定了最佳色谱条件：TOSOH Tskgel oApak-A色谱柱，示差检测器(RID)，流动相0.75 mmol/L H2SO4，流速1.0 mL/min，柱温45 ℃。

2)该方法前处理简单、精密度好、灵敏度高，比常规化学滴定法省时、省力，为衣康酸发酵工艺改进的研究及适时监控提供了方便。

[1] 刘建军,姜鲁燕,李丕武,等.衣康酸的性质、生产及应用[J].山东科学,2002,15(3):38-42.

[2]何敏超,张宇,许敬亮,等.衣康酸产业的现状和展望[J].中国酿造,2012,31(11):8-11.

[3]贾士儒,王明霞,陈贵斌,等.衣康酸发酵工艺的初步研究[J].食品与发酵工业,1999,25(2):39-42.

[4]刘建军,姜鲁燕,李丕武,等.发酵法生产衣康酸技术的研究-衣康酸发酵工艺条件的研究(Ⅱ)[J].食品与发酵工业,2003,29(4):27-32.

[5]徐建春,李霞,王海英.发酵法生产衣康酸-高产菌株的选育[J].发酵科技通讯,2008,37(1):30-32.

[6]白冬梅,杜国民,沈菲,等.反相HPLC同时测定产琥珀酸放线杆菌发酵液中的有机酸与葡萄糖[J].分析试验室,2004,23(3):15-18.

[7]白冬梅,赵学明,胡宗定,等.反相HPLC双控检测器法同时测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸与葡萄糖[J].食品与发酵工业,2000,27(11):13-17.

[8]马瑞,欧阳嘉,李鑫,等.高效液相色谱法同时测定生物质乳酸发酵液中有机酸及糖类化合物[J].色谱,2012,30(1):62-66.

SimultaneousdeterminationofItaconicAcidandSaccharidesinItaconicAcidFermentationBrothofAspergillusterreusbyHighPerformanceLiquidChromatography

LIU Lan,HUANG Xiaoping,XIONG Dawei,HUANG Guochang,ZHANG Ting

(Jiangxi Academy of Science. Institute of Microbiology,330096,Nanchang,PRC)

A high performance liquid chromatographic method for rapid determination of itaconic acid and saccharides in itaconic acid fermentation broth ofAspergillusterreuswas developed.A TOSOH Tskgel oApak-A column was used at 45 ℃ and the mobile phase was 0.75 mmol/L H2SO4at a flow rate of 1.0 mL/min.Under the optimized conditions.The itaconic acid and glucose in samples were determined and completely separated within 20 min by a refractive index detector (RID).The Linear correlation coefficient for itaconic acid was 0.999 9 in the range of 0～10.056 g/L.The Linear correlation coefficient for glucose was 0.999 9 in the range of 0～6.016 g/L.The relative standard deviation (RSD,n=6) of itaconic acid and glucose was 0.33% and 0.15% respectively.The recovery rate was 100.88%～102.74% and of 101.26%～103.12% separately.This method established is proved to be fast and accurate for the quantitative analysis of the itaconic acid and glucose in fermentation broth ofAspergillusterreus.

high performance liquid chromatography(HPLC);itaconic acid;glucose;Aspergillusterreus;fermentation broth

2014-10-13;

2014-11-17

刘 兰(1969-)，女，本科，研究方向：有机酸发酵。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.06.027

O658

A

1001-3679(2014)06-0865-04