Folin-Ciocalteu法测定山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的研究

杨 晖，和素娜，杜景霞，李 艳，路西明，王建刚，吕茂平

Folin-Ciocalteu法测定山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的研究

杨 晖1，和素娜1，杜景霞1，李 艳1，路西明1，王建刚1，吕茂平2

目的以没食子酸为标准物质，研究Folin-Ciocalteu法测定山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的优化条件。方法以吸光度为评价指标，分别研究了检测波长、Folin-Ciocalteu试剂用量、Na2CO3用量、反应温度及反应时间对测定结果的影响。结果优化测定条件：检测波长760 nm，0.4 mL样品加入Folin-Ciocalteu试剂1.0 mL、10%Na2CO3溶液3.2 mL，反应温度35 ℃，显色反应时间1.0 h，吸光度与多酚含量在0～250 μg/mL范围内呈良好的线性关系(y=0.0053x+0.0389，R2=0.9993)。方法的加标回收率为98.5%～103.0%，相对标准偏差为1.9%～2.3% (n=6)。三批山茱萸果核水溶性提取物多酚含量平均值为39.24%。结论Folin-Ciocalteu法在本研究建立的优化测定条件下显色灵敏、准确可靠、稳定性高、简便易行，适用于山茱萸果核水溶性提取物多酚的含量测定。

Folin-Ciocalteu法；山茱萸果核；水溶性提取物；多酚

山茱萸(CornusoficinalisSeib．etZucc)作为传统中药材，市场需求量很大，但因通常只使用干燥成熟果肉入药，导致含有大量营养物质的果核被丢弃，造成资源浪费[1-2]。多酚是植物体内重要的次生代谢产物，具有抗肿瘤、抗氧化以及抗菌等多种生理功能[3-5]。已有的山茱萸果核化学成分的研究表明其含有较多的多酚类物质[6]，但有关山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的测定研究还未见报道。Folin-Ciocalteu法是常用的植物多酚测定方法，具有操作简便、准确度和精密度高等优点，但不同样品的测定条件有较大差别[7-8]。本文研究了Folin-Ciocalteu法测定山茱萸果核水溶性提取物多酚含量的优化条件，以期为其药用价值研究与综合利用提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂可见分光光度计722s(上海棱光)；三用恒温水箱HH-600J(金坛市杰瑞尔电器有限公司)；旋转蒸发仪RE52CS-1(上海亚荣生化仪器厂)；冷冻干燥机FD-1D-50(北京博医康实验仪器有限公司)；分析天平FA2204B(上海精科天美科学仪器有限公司)；山茱萸果核采集于河南省洛阳市嵩县，经河南科技大学路西明教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果核；没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201204)；Folin-Ciocalteu试剂(国药集团化学试剂有限公司)；其余试剂均为分析纯，实验用水为去离子蒸馏水。

1.2 样品制备取800 g粉碎后的山茱萸果核置于渗漉柱中，加石油醚脱脂，直至渗漉液和石油醚颜色相同时停止。将脱脂后的果核晾干后重新置于渗漉柱中，加丙酮渗漉，直至用FeCl3溶液检测渗漉液结果为阴性时停止。将渗漉液置于50℃下旋转蒸发，蒸干后所得黏稠物质，冷却后用水分散。将分散液置于分液漏斗中，依次用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取(水层与有机溶剂的体积比为1.5∶1)，最后将所得水层经70℃旋转蒸发和-49℃冷冻干燥处理后得到水溶性提取物。

1.3 方法

1.3.1 没食子酸标准溶液的配制 精确称取没食子酸100 mg，用水溶解并定容至100 mL，然后精确移取5.00 mL 于50 mL容量瓶中并定容，即得到质量浓度100 μg/mL的没食子酸标准溶液。

1.3.2 供试品溶液的配制 精确称取山茱萸果核水溶性提取物50 mg，用水溶解并定容至50 mL，然后精确移取5.00 mL于25 mL容量瓶中并定容。

1.3.3 测定条件的优化 ①检测波长：用移液管分别移取100 μg/mL没食子酸标准溶液和供试品溶液各0.4 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入1.0 mL水、1.0mL Folin-Ciocalteu试剂，混匀静止3 min后加入3.0 mL 10% Na2CO3溶液，用水定容，常温下反应1.5 h后，用紫外—可见分光光度计在400～800 nm范围内扫描，从而选择最佳测定波长。②Folin-Ciocalteu试剂用量：取6份0.4 mL的100 μg/mL没食子酸标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，分别依次加入1 mL水和不同体积(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL)的Folin-Ciocalteu试剂，混匀静止3 min后加入3.2 mL 10% Na2CO3溶液，用水定容，室温下反应1.5 h后，在最佳测定波长处测量吸光度，以确定Folin-Ciocalteu试剂的最佳用量。③Na2CO3用量：取6份0.4 mL的100 μg/mL没食子酸标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，加入1.0 mL水和最佳用量的Folin-Ciocalteu试剂，混匀静止3 min后分别加入不同体积(0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 mL)的10% Na2CO3溶液，用水定容，常温下反应1.5 h后，在最佳测定波长处测量吸光度，以确定碳酸钠溶液的最佳用量。④显色温度：取6份0.4 mL的100 μg/mL没食子酸标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，加入1.0 mL水和最佳用量的Folin-Ciocalteu试剂，混匀静止3 min后加入最佳用量的10%Na2CO3溶液，用水定容，分别在温度25、30、35、40、45、50 ℃时反应1.5 h，在最佳测定波长处测量吸光度，以确定显色反应的最适温度。⑤显色时间：取6份0.4 mL的100 μg/mL没食子酸标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，依次加入1.0 mL水和最佳用量的Folin-Ciocalteu试剂，混匀后等待3 min，再加入最佳用量的10% Na2CO3溶液，用水定容，在最适温度下分别反应0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后，在最佳测定波长处测量吸光度，以确定显色反应完全所需的时间。

1.3.4 标准曲线的建立 分别配制0、10、25、50、100、200、250 μg/mL没食子酸标准溶液，按1.3.3节优化的测定条件，测定吸光度。以标准溶液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5 样品含量的测定 精确移取供试品溶液各0.4 mL于10 mL棕色容量瓶中，按1.3.3中优化的测定条件，测定吸光度，然后根据标准曲线计算出样品中多酚的含量。

2 结果

2.1 测定条件的优化

2.1.1 检测波长 经测试，没食子酸和供试品溶液均在760 nm出现最大吸收峰，因此760 nm即为最佳检测波长。

2.1.2 Folin-Ciocalteu试剂用量 Folin-Ciocalteu试剂的用量对显色反应的程度有影响，试验表明，吸光度随着Folin-Ciocalteu试剂用量的增加而增大，但在用量超过1.0 mL后，吸光度不再有明显变化，因此Folin-Ciocalteu试剂的最佳用量为1.0 mL。

2.1.3 Na2CO3用量 显色溶液的碱性强弱对多酚类化合物的显色效果具有一定的影响，试验表明，Na2CO30.8～2.4 mL，随着Na2CO3溶液用量的增加，吸光度明显增大，但加入量达到2.4 mL以后，吸光度的增长趋缓，在3.2 mL时达到最大值，因此10%Na2CO3的最佳用量为3.2 mL。

2.1.4 显色温度 温度影响多酚物质的稳定性，试验表明，25～35℃时，吸光度随着温度的升高逐步增大，在35～45℃时吸光度值趋于稳定，温度高于45℃时，随着温度的增加吸光度逐渐变小，因此显色反应最适温度为35℃。

2.1.5 显色时间 试验表明，当显示时间在1.5 h以内时，吸光度随着反应时间的延长而逐渐增大，在1.0 h时吸光度达到最大，1.0 h后标准溶液的吸光度稍有下降，但基本趋于稳定，因此最适反应时间确定为1.0 h。

2.2 标准曲线的建立试验结果表明，在优化的测定条件下，没食子酸标准溶液的吸光度与质量浓度在0～250 μg/mL范围内呈较好的线性关系，标准曲线方程为：y=0.0053x+0.0389，R2=0.9993。

2.3 分析方法的评价

2.3.1 重复性 取0.4 mL供试品溶液于10 mL棕色容量瓶中，按优化的测定条件连续测定6次吸光度，分别为0.475、0.474、0.473、0.473、0.474和0.473，相对标准偏差为0.17%。

2.3.2 稳定性实验 取0.4 mL供试品溶液于10 mL棕色容量瓶中，按优化的测定条件反应1.0 h后，于2.5 h内每隔30 min，在760 nm处测定一次吸光度，分别为0.476、0.473、0.469、0.467、0.466和0.462，相对标准偏差为1.2%。

2.3.3 精密度实验 分别取6份0.4 mL供试品溶液于10 mL棕色容量瓶中，按优化的测定条件测定吸光度，根据2.2中所得的标准曲线计算，得到供试品溶液中多酚含量分别为80.6、81.4、80.3、83.9、81.7和82.5 μg/mL，平均值为81.7 μg/mL，相对标准偏差为1.6%。

2.3.4 加标回收实验 向已知含量的供试品溶液中，分别加入一定浓度的没食子酸标准溶液，按优化的测定条件测定吸光度，根据2.2中所得的标准曲线计算没食子酸的回收率和实验结果的相对标准偏差，结果见表1。

表1 加标回收实验结果

2.4 样品含量的测定在优化条件下进行了3批山茱萸果核多酚水溶性提取物供试品溶液的吸光度测定，并将结果代入2.2中所得的标准曲线计算供试品溶液中多酚的含量，然后经换算得到样品中多酚含量的结果分别为：39.45%、38.43%和39.83%，平均值为39.24%，相对标准偏差为1.8%。

3 讨论

实验结果表明，以没食子酸为标准物质，用Folin-Ciocalteu法测定山茱萸果核水溶性提取物中的多酚含量的优化条件为：供试品溶液0.4 mL、Folin-Ciocalteu试剂1.0 mL、10%Na2CO3溶液3.2 mL、反应时间1.0 h、反应温度35 ℃，测定波长760 nm，吸光度与多酚含量在0～250 μg/mL范围内呈良好的线性关系。方法的重复性和稳定性较好，精密度高，加标回收率为98.5%～103.0%，相对标准偏差为1.9%～2.3% (n=6)，可用于实际样品的测定，结果令人满意，可为山茱萸果核水溶性提取物的相关药用研究与利用提供依据。

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StudyonDeterminationofPolyphenolsinWater-solubleExtractofCornusOfficinalisKernelsbyFolin-CiocalteuMethod

YANG Hui,HE Su-na,DU Jing-xia,et al

(Medical College,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveThe optimum conditions of Folin-Ciocalteu method for the determination of polyphenols content in the water-soluble extract of cornus officinalis kernels was studied by using gallic acid as the standard substance.MethodsAbsorbency was adopted as evaluation index,factors that influenced the detection performance,such as the detection wavelength,the amount of Folin-Ciocalteu reagent,the amount of sodium carbonate,reaction time and reaction temperature were investigated.ResultsThe optimum conditions for polyphenols determination by Folin-Ciocalteu method were as follows: 1.0 mL of Folin-Ciocalteu reagent was added in 1.0 mL of sample,and then 3.2 mL of 10% sodium carbonate solution was added.After the coloration reaction was for 1.0 h at 35℃,the absorbance was measured at 760 nm.Under the optimum conditions,the absorbance increased linearly with the concentration of gallic acid in the range of 0 to 250 μg/mL (y=0.0053x+0.0389,R2=0.9993).The average spiked recoveries were 98.5%～103.0% with the relative standard deviations of 1.9%～2.3% (n=6).The average value of polyphenols content in the water-soluble extract of cornus officinalis kernels from three batches was 39.24%.ConclusionFolin-Ciocalteu method established in this study is simple,fast,highly sensitive and very stable.It is suitable to be applied to determine polyphenols content in the water-soluble extract of cornus officinalis kernels.

Folin-Ciocalteu method；cornus officinalis kernel；water-soluble extract；polyphenol

河南省重点科技攻关项目(No.082102310031)

河南科技大学校青年基金资助项目(2012QN014)

2014-04-08

1.河南科技大学医学院，河南洛阳 471003 2.国家知识产权局专利审查协作中心，北京 100083

杨晖(1982-)，女，河南洛阳人，博士，讲师，从事药物分析教学与研究工作。

R284.1

A

1672-688X(2014)02-0084-03