胃癌干细胞的分离鉴定以及干细胞特性研究*

李 霞 徐桂芳 张伟杰 周志华 郭 明 邹晓平

南京大学医学院附属鼓楼医院消化内科1(210008) 急诊外科2解放军第101医院病理科3 南京中医药大学4

肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是指一类存在于肿瘤内部，具有自我更新和肿瘤形成能力的细胞，可进一步“分化”形成肿瘤细胞，是肿瘤增殖生长、侵袭、转移、复发以及化疗耐药的根源[1]，CSCs已成为当前肿瘤研究的热点之一。胃癌干细胞(gastric cancer stem cells, GCSCs)于近年在胃癌细胞株、原发肿瘤组织和患者外周血中被鉴定，表面标记物CD44可作为识别GCSCs的标记[2-3]，其他干细胞标记物如CD54以及胃壁细胞标记物H+/K+-ATPase亦被用于识别GCSCs[3-4]。然而迄今为止，GCSCs的特性尚未得到很好的研究。本实验采用悬浮培养法从人胃癌细胞株中分离GCSCs样细胞，以CD44、CD54和H+/K+-ATPase免疫荧光标记进行鉴定，并观察GCSCs富集的肿瘤球的自我更新和增殖、迁移、侵袭能力以及对顺铂的耐药性，旨在加深对GCSCs干细胞特性的认识，为其“干性”研究提供新的实验依据。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人胃癌细胞株MKN45、MGC803、SGC7901由南京市鼓楼医院消化内科实验室保存。RPMI 1640培养基、DMEM/F-12培养基、FBS(Wisent Inc.)，表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(PeproTech)，CD44、CD54、H+/K+-ATPase抗体(Merck Millipore)，DyLight 488 AffiniPure绿色荧光二 抗(Abbkine, Inc.)，Transwell小室(Corning Costar®)，CCK-8试剂盒(Dojindo Molecular Technol-ogies, Inc.)，顺铂(南京市鼓楼医院)。

二、方法

1. 胃癌细胞和肿瘤球培养：MKN45、MGC803、SGC7901细胞常规使用含10% FBS的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。分别将2×105MKN45、MGC803、SGC7901细胞悬浮培养于干细胞培养基(含20 μg/L EGF、10 μg/L bFGF、不含血清的DMEM/F-12培养基)中，每5 d机械分离一次培养形成的肿瘤球以除去球中心凋亡细胞，即将肿瘤球离心并转移至含10% FBS的RPMI 1640培养基中贴壁培养3 h，然后再次悬浮培养于无血清培养基中，由此得到第二代、第三代悬浮的肿瘤球。以下各步骤实验均使用对数生长期胃癌细胞，各实验步骤均设3个复孔或重复3次，结果取均值。

2. 集落形成实验：取胃癌细胞及其第三代贴壁后肿瘤球，含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，以200/孔接种于加入适量含10% FBS的RPMI 1640培养基的6孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱内静置培养2周，结晶紫染色，计数超过50个细胞的克隆集落。

3. 免疫荧光法检测GCSCs标记物：取胃癌细胞及其第三代贴壁后肿瘤球，EDTA-胰蛋白酶消化，制成5×104/mL单细胞悬液，接种于加入适量含10% FBS的RPMI 1640培养基的24孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱内静置培养过夜以诱导分化。次日取出细胞至室温，吸弃培养基，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤，10%山羊血清封闭1 h，分别标记兔抗人CD44(1∶100)、鼠抗人CD54(1∶100)、山羊抗人H+/K+-ATPase(1∶200)抗体，4 ℃过夜，加入二抗(DyLight 488标记的山羊抗兔、山羊抗鼠、兔抗山羊IgG，1∶50)，室温孵育1 h，DAPI标记细胞核，荧光显微镜下观察。

4. 细胞划痕实验：以Marker笔在6孔板背后借助直尺均匀划横线，每隔0.5～1 cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条横线。取胃癌细胞及其第三代贴壁后肿瘤球，EDTA-胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，每孔加入约5×105个细胞，次日以100 μL枪头借助直尺尽量垂直于背后横线划痕，PBS洗涤3次以除去划下的细胞，加入含1%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱内培养，分别于0 h、24 h时取样、拍照。

5. 细胞侵袭实验：于Transwell小室上室面涂布Matrigel基质胶。取胃癌细胞及其第三代贴壁后肿瘤球，EDTA-胰蛋白酶消化，以无血清RPMI 1640培养基制成1×105/mL单细胞悬液，于上室中加入200 μL悬液，下室中加人600 μL含10% FBS的RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h。取出小室，以棉签拭去上室面未侵袭细胞，PBS洗涤，结晶紫染色10 min，清洗风干，光学显微镜下观察、计数膜背面侵袭细胞(穿膜细胞)，计数中央和四周共5个视野(×400)，结果取均值。

6. CCK-8实验：取SGC7901细胞及其第三代贴壁后肿瘤球，EDTA-胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，以5 000/孔接种于96孔板，每孔100 μL，24 h细胞贴壁后实验组每孔加入100 μL顺铂溶液，终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100 μg/mL，对照组加入100 μL培养基，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。各组细胞培养不同时间后自培养箱中取出，每孔加入CCK-8 10 μL，孵育1 h，使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度(A)值。细胞生长抑制率= (A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白组)×100%。

三、统计学分析

结 果

一、胃癌细胞肿瘤球形成和自我更新、增殖能力

于无血清培养基中悬浮培养5 d后，3株人胃癌细胞均具有形成肿瘤球体的能力，同时大部分悬浮细胞发生凋亡，形成外观松散的第一代肿瘤球，而随后的第二、第三代肿瘤球外观逐渐变得致密(图1)，数量亦逐渐增多，提示GCSCs富集。集落形成实验显示，肿瘤球形成的克隆集落体积和数量均大于普通胃癌细胞(图2A、2B)，表明GCSCs富集的肿瘤球克隆形成能力较普通胃癌细胞强。

二、胃癌细胞肿瘤球GCSCs标记物鉴定

免疫荧光法检测显示，与普通胃癌细胞相比，肿瘤球高表达干细胞标记物CD44、CD54，但低表达胃壁细胞标记物H+/K+-ATPase(图3)。本课题组前期研究采用流式细胞术标记CD44，亦证实分离自MKN45、SGC7901两株人胃癌细胞的GCSCs CD44阳性率分别为92.5%±4.8%和82.1%±8.6%，分别显著高于相应普通胃癌细胞(67.9%±6.5%和53.0%±3.8%)。上述结果提示GCSCs富集的肿瘤球具有多向分化潜能。

三、胃癌细胞肿瘤球的迁移、侵袭能力

细胞划痕实验显示，在低血清条件下，普通胃癌细胞迁移速度缓慢，24 h后划痕与0 h时相比变化不明显，肿瘤球24 h后划痕愈合则较明显(图4A)，细胞迁移速度显著大于普通胃癌细胞(图4B)。细胞侵袭实验显示，于Transwell小室上室中加入细胞数量相同的悬液，24 h后肿瘤球穿膜细胞数显著多于普通胃癌细胞(图5A、5B)。上述结果表明GCSCs富集的肿瘤球与普通胃癌细胞相比具有更强的迁移、侵袭能力。

图1 胃癌细胞不同代肿瘤球形成(×200)

A：肿瘤球克隆形成能力较普通胃癌细胞强(×40)；B：两组克隆形成定量分析(*P<0.05)

图3 胃癌细胞及其肿瘤球干细胞标记物和胃壁细胞标记物免疫荧光检测(×200)

A：肿瘤球划痕愈合速度较普通胃癌细胞快(×40)；B：两组迁移速度定量分析(*P<0.01)

四、胃癌细胞肿瘤球的化疗耐药性

CCK-8实验显示，经不同浓度顺铂干预24 h后，低浓度(0.01、0.1、1 μg/mL)顺铂处理组肿瘤球生长抑制率显著低于普通胃癌细胞，而高浓度(10、100 μg/mL)顺铂处理组细胞大部分已死亡，肿瘤球与普通胃癌细胞间生长抑制率差异无统计学意义(图6A)，细胞生存率曲线显示顺铂对肿瘤球的50%抑制浓度(IC50)明显高于普通胃癌细胞(图6B)，表明GCSCs富集的肿瘤球与普通胃癌细胞相比更易对化疗药物产生耐药。

A：肿瘤球侵袭能力较普通胃癌细胞强(×400)；B：两组侵袭细胞定量分析(*P<0.01)

A：不同浓度顺铂干预24 h后肿瘤球和普通胃癌细胞生长抑制率比较(*P<0.01)；B：两组细胞的生存率曲线

图6SGC7901细胞及其肿瘤球对顺铂的耐药性

讨 论

自从Bonnet等[5]证明人类急性髓性白血病中存在CSCs以来，各种证据表明在肿瘤与机体的相互作用中，肿瘤最终的进展和转移系由CSCs与局部微环境的相互作用所介导[6]。CSCs与组织干细胞有许多共同点，如自我更新、增殖、耐药等，并主要负责维持肿瘤生长增殖[7]。开展CSCs相关研究的首要问题是分离、鉴定该类细胞，目前针对CSCs的分离方法主要有荧光激活细胞分选法(FACS)、侧群细胞(SP细胞)亚群分选法和悬浮培养法。悬浮培养法早期用于干细胞的研究，近年已应用该法在包括胃癌在内的多种实体肿瘤中成功分离、鉴定出CSCs。本课题组前期研究[8]证实，基于克隆形态的分选策略可从人胃癌细胞株AGS中分离出GCSCs克隆。本实验选用3株人胃癌细胞MKN45、MGC803、SGC7901，在含EGF、bFGF的无血清培养基中成功培养出悬浮的肿瘤球。该法操作简单，且可动态观察肿瘤球的变化。实验结果显示肿瘤球培养至第二、第三代后变得更为致密，数量增多，具有更强的自我更新能力(即在无血清培养条件下形成悬浮肿瘤球的能力)和增殖能力(即克隆形成能力)。

GCSCs目前仍缺乏高特异性的干细胞标记物，其表面标记物尚存在争议。跨膜糖蛋白CD44是公认的前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的CSCs标记[9]，目前被用作GCSCs的标记物亦较多见。CD54又名细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，是一个相对分子质量为90 kDa(1 Da=0.992 1 u)的免疫球蛋白超家族成员，广泛表达于肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。Chen等[3]从胃腺癌患者的肿瘤组织和外周血中分离得到CD44+CD54+细胞群，该细胞群可形成肿瘤球，并具有自我更新和分化能力。因此，本实验选用CD44和CD54作为标记物鉴定肿瘤球中的GCSCs，同时选用胃壁细胞标记物H+/K+-ATPase鉴定干细胞的多向分化能力，结果显示与普通胃癌细胞相比，GCSCs富集的肿瘤球高表达CD44、CD54，低表达H+/K+-ATPase，表明其具有多向分化潜能。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是一种基本生理病理现象，参与了肿瘤的侵袭和转移过程。在EMT过程中，上皮细胞失去细胞黏附分子E-cadherin，获得间质标记物如波形蛋白(VIM)以及迁移、侵袭能力[10-11]。胃癌患者骨髓组织中存在VIM mRNA表达上调并与肿瘤临床分期、侵袭和淋巴结转移相关，且一些侵袭瘤内血管的肿瘤细胞VIM蛋白呈强阳性染色，证实胃癌细胞存在EMT[12]。令人感兴趣的是，近年研究[13]发现CSCs具有EMT特性，而经历EMT的肿瘤细胞亦呈现CSCs特性，表明EMT与CSCs之间有直接联系。已有研究[4]发现分离自人胃癌细胞株SGC7901的GCSCs样细胞具有高侵袭、转移能力并呈现EMT表型，本研究亦通过细胞划痕实验和Transwell小室细胞侵袭实验证实，与普通胃癌细胞相比，GCSCs富集的肿瘤球具有更强的迁移、侵袭能力。此种能力系通过何种途径获得、是否与EMT有关，均有待进一步研究。

胃癌患者对放化疗易产生耐受，肿瘤转移、复发率高，预后较差，究其根源与常规治疗对GCSCs 的靶向性不强有关，选择性靶向GCSCs有望成为有效的胃癌治疗手段[1]。本课题组前期研究[8]显示GCSCs对5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性较低，表明GCSCs对化疗药物耐受可能是胃癌化疗耐药的重要机制之一。顺铂是临床常用胃癌化疗药物，亦为胃癌体外药敏试验最常选用的经典药物之一，胃癌细胞对顺铂产生耐药是含顺铂化疗方案疗效降低的主要原因[14]。本实验结果显示，顺铂对GCSCs富集的肿瘤球的IC50值明显高于普通胃癌细胞，提示GCSCs较普通胃癌细胞更易对化疗药物产生耐药，其耐药机制有待进一步研究。

综上所述，应用无血清培养基悬浮培养法能成功获得GCSCs富集的肿瘤球；肿瘤球高表达干细胞标记物CD44、CD54，具有较强的自我更新、增殖、迁移、侵袭能力和多向分化潜能，对化疗药物更易产生耐药性。基于上述特点，推测胃癌易发生侵袭、转移以及对常规化疗药物产生耐药与GCSCs有关，靶向调节GCSCs的具体机制及其应用于胃癌治疗的可行性，尚待进一步研究。

1 Scopelliti A, Cammareri P, Catalano V, et al. Therapeutic implications of Cancer Initiating Cells[J]. Expert Opin Biol Ther, 2009, 9 (8): 1005-1016.

2 Takaishi S, Okumura T, Tu S, et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44[J]. Stem Cells, 2009, 27 (5): 1006-1020.

3 Chen T, Yang K, Yu J, et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients[J]. Cell Res, 2012, 22 (1): 248-258.

4 Yang L, Ping YF, Yu X, et al. Gastric cancer stem-like cells possess higher capability of invasion and metastasis in association with a mesenchymal transition phenotype[J]. Cancer Lett, 2011, 310 (1): 46-52.

5 Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J]. Nat Med, 1997, 3 (7): 730-737.

6 Vermeulen L, De Sousa E Melo F, van der Heijden M, et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment[J]. Nat Cell Biol, 2010, 12 (5): 468-476.

7 Vermeulen L, Sprick MR, Kemper K, et al. Cancer stem cells-old concepts, new insights[J]. Cell Death Differ, 2008, 15 (6): 947-958.

8 周志华，张建东，徐桂芳，等. 基于克隆形态分选胃癌干细胞及其对氟尿嘧啶敏感性的检测[J]. 中华胃肠外科杂志, 2013, 16 (4): 376-380.

9 Patrawala L, Calhoun T, Schneider-Broussard R, et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells[J]. Oncogene, 2006, 25 (12):1696-1708.

10 Yilmaz M, Christofori G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion[J]. Cancer Metastasis Rev, 2009, 28 (1-2): 15-33.

11 Thiery JP, Acloque H, Huang RY, et al. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J]. Cell, 2009, 139 (5): 871-890.

12 Iwatsuki M, Mimori K, Fukagawa T, et al. The clinical significance of vimentin-expressing gastric cancer cells in bone marrow[J]. Ann Surg Oncol, 2010, 17 (9): 2526-2533.

13 Mani SA, Guo W, Liao MJ, et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J]. Cell, 2008, 133 (4): 704-715.

14 Chun JH, Kim HK, Lee JS, et al. Weekly irinotecan in patients with metastatic gastric cancer failing cisplatin-based chemotherapy[J]. Jpn J Clin Oncol, 2004, 34 (1): 8-13.