荭草苷与DNA相互作用的机理研究

刘 炜， 刘 红

(海南师范大学 化学与化工学院， 海口 571158)



荭草苷与DNA相互作用的机理研究

刘 炜*， 刘 红

(海南师范大学 化学与化工学院， 海口 571158)

应用荧光探针、紫外光谱技术和黏度法研究了荭草苷和DNA分子间的相互作用.研究结果表明，在pH为7.4的Tris-HCl缓冲体系中，荭草苷可将盐酸小檗碱从DNA双螺旋中挤出，导致其荧光猝灭.根据热力学参数确定了荭草苷与DNA主要以疏水作用力结合；25℃和40℃两个不同温度下荭草苷与DNA之间的结合常数分别为1.541×103L·mol-1和1.602×103L·mol-1， 结合位点数分别为0.7888和0.7242；黏度实验进一步证明荭草苷是以嵌入结合的方式与DNA结合.

荭草苷； DNA； 相互作用； 光谱

DNA是细胞和病毒的重要组成部分，是重要的遗传物质.药物与DNA发生作用可能会影响到DNA的转录和复制，从而起到抗癌、抑菌和抗病毒的作用.研究药物分子与DNA的作用，可以从分子水平上阐明药物的药效，对药物分子合成与设计具有重要意义.以DNA作为药物作用靶是有效的新兴的药物筛选和新药设计研究方法[1-2].

荭草苷属于黄酮苷类化合物，存在于金莲花、葫芦巴、竹叶等植物中，具有抗氧化、抗癌、抗病毒的药理活性，其分子式如图1.有关其与DNA的相互作用研究尚未见报道，因此，本文主要通过紫外吸收光谱法、荧光光谱法研究荭草苷与DNA相互作用的机理.

图1 荭草苷结构式Fig.1 The structure of orientin

1实验部分

1.1仪器与试剂

TU-1901紫外可见分光光度计(普析通用)，PHS-25型pH计(上海雷磁)，日立F-4500荧光分光光度仪(日本)．

DNA 贮备液：称取0.1 g的鲱鱼精DNA(Sigma公司)以二次蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中，由在260 nm处的吸光度(ε=6 600 L·mol-1·cm-1)确定其浓度，冰箱中冷藏.

荭草苷(中检所，纯度≥99.8%)贮备液:称取一定量的荭草苷，用乙醇定容至100 mL的容量瓶中配制成浓度为10-3mol/L，置于0～4℃下保存.

0.1 mol/L pH7.4的Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲溶液.

1.2实验方法

在10 mL容量瓶中依次加入1.0 mL的缓冲溶液、0.4 mL DNA和不同量的荭草苷，定容、摇匀，以试剂空白为参比，进行紫外吸收光谱的测定.

在10 mL的容量瓶中依次加入1.0 mL的缓冲溶液、0.2 mL小檗碱、DNA溶液，以及不同量的荭草苷工作溶液，定容、摇匀，进行荧光光谱的测定.荧光激发波长定为358 nm，荧光发射峰位为532 nm，狭缝宽均为5 nm.

2结果与讨论

2.1荭草苷对DNA紫外吸收光谱的影响

图2为荭草苷对DNA紫外吸收光谱的影响.从图2中可以看出，DNA在257 nm处有一最大紫外吸收峰，连续加入荭草苷后，其吸收度持续增强，表明DNA发生了增色效应.由于DNA在257 nm处的吸收峰来自于其碱基对间的电子传递，这说明荭草苷可能嵌入到DNA双螺旋中，改变了DNA的双螺旋结构，影响了碱基对间的电子传递，从而发生了增色效应.

(pH=7.4; CDNA=1.2×10-4 mol/L; a→e:Corientin=0，2，4，6，8×10-5 mol/L) 图2 荭草苷对DNA紫外吸收光谱的影响Fig.2 The UV absorption spectra of DNA in the presence of orientin

2.2荭草苷对BR-DNA体系荧光光谱的影响

盐酸小檗碱(BR)可作为荧光探针研究小分子化合物与DNA的相互作用，当药物小分子插入到DNA双螺旋中时，可与小檗碱发生竞争结合DNA的反应，将小檗碱从双螺旋中挤出，从而荧光强度降低[3-4].连续向小檗碱-DNA体系中加入不同量的荭草苷，实验结果如图3所示，小檗碱-DNA体系在532 nm处有一显著荧光发射峰，随着荭草苷的连续加入，其荧光强度持续下降，说明荭草苷对小檗碱-DNA体系发生了荧光猝灭作用.

2.3荧光猝灭方式的判断

将荭草苷对BR-DNA的猝灭光谱所得荧光强度代入动态猝灭Stern-Volmer方程[5]:

F0/F=1+Kqτ0c=1+Ksvc，

(1)

求得在298 K时， 荭草苷对BR-DNA的Stern-Volmer猝灭常数Ksv为1.2125×104L/moL， 则其双分子速率常数Kq为1.2125×1012L·mol-1·s-1(DNA等生物大分子的τ0约为10-8s-1)，远大于生物大分子最大动态猝灭常数2.0×1010L·mol-1·s-1[6]，因此荭草苷对BR-DNA的荧光猝灭是因为形成复合物所产生的静态猝灭(图4).实验结果表明，荭草苷与DNA是以嵌入方式结合，导致小檗碱被挤出DNA双螺旋，从而发生荧光猝灭.

(pH=7.4; CBR=2×10-5mol/L; CDNA=6×10-5mol/L; a→h:Corientin=0， 1， 2， 3， 5， 6， 7， 8×10-5mol/L)图3 荭草苷对小檗碱-DNA体系荧光 发射光谱的影响Fig.3 The fluorescence emission spectra of BR-DNA in the presence of orientin

(pH=7.4; CBR=2×10-5 mol/L; CDNA=6×10-5 mol/L) 图4 荭草苷-BR-DNA的stern-volmer方程Fig.4 Stern-Volmer curves for the binding of orientin to BR-DNA at 298 K

2.4荭草苷与DNA的结合常数和结合位点数

由静态猝灭公式[7]

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlgcM,

(2)

分别作出不同温度下荭草苷-DNA体系的关系图.结果如图5，通过外推截距和斜率可求出25℃和40℃荭草苷与DNA之间的结合常数分别为1.541×103L·mol-1和1.602×103L·mol-1，结合位点数分别为0.7888和0.7242.

(pH=7.4; CBR=2×10-5 mol/L; CDNA=6×10-5 mol/L; a:25℃，b:40℃)图5 荭草苷与 DNA反应的 lg[(F0 -F)/F]～lgC关系图Fig.5 The plot of lg[(F0 -F)/F] vs lgC of the reaction between orientin and DNA

2.5荭草苷与DNA结合反应的热力学性质及作用力的影响

根据热力学公式可以计算药物小分子与生物大分子作用间的有关热力学参数[8-9]:

ln(K2/K1)=ΔHm(1 /T1-1 /T2) /R，

(3)

ΔGm=-RTlnK，

(4)

ΔSm=(ΔHm-ΔGm) /T .

(5)

根据热力学参数可以简单判断其相互作用类型：ΔH > 0及ΔS > 0为疏水作用，ΔH < 0及ΔS > 0为静电作用，ΔH < 0及ΔS < 0为氢键或者范德华作用[10-12].

根据荭草苷与DNA的结合常数可以求得二者结合过程的热力学参数:

ΔHm=2023J·mol-1，

ΔGm(298K)=-18.17kJ·mol-1，

ΔSm(298K)=67.76J·K-1·mol-1.

由此可判断荭草苷与DNA主要是以疏水作用力结合.

2.6荭草苷与DNA反应的黏度研究

当药物分子以嵌入的方式与DNA结合，则DNA双螺旋变长，黏度增加[10，13].向固定浓度的DNA溶液中加入不同量的荭草苷，由实验结果按下式计算相对黏度：

η=(t-t0)/t0，

式中t0为空白溶液流经毛细管所需时间，t为含不同量荭草苷的DNA溶液流经毛细管所需时间，以(η/η0)1/3对结合比率r(Corientin/CDNA)作图，η0为未加入荭草苷时DNA的黏度[10]，如图6所示，随着荭草苷浓度的增大，DNA相对黏度逐渐增高，由此可知荭草苷与DNA以嵌入方式结合，结果与荧光、紫外光谱结果相吻合.

(pH=7.4; CDNA=3×10-4mol/L)图6 荭草苷对DNA相对黏度的影响Fig.6 The effect of orientin on the relative viscosity of DNA

3结论

本论文利用荧光光谱法和紫外吸收光谱法研究了荭草苷与DNA相互作用的机理，实验结果表明，荭草苷与DNA主要通过疏水作用力以嵌入模式结合，从而改变了DNA的双螺旋结构，影响了其复制，这可能是其具有抗癌、抗病毒活性的原因之一.25℃和40℃两个不同温度下下荭草苷与DNA之间的结合常数分别为1.541×103和1.602×103L·mol-1，结合位点数分别为0.788 8和0.724 2.

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Study on the interaction of orientin and DNA

LIU Wei， LIU Hong

(College of Chemistry and Chemical Engineering， Hainan Normal University， Haikou 571158)

The interaction of orientin and DNA was studied using fluorescent probe， UV spectrometry and viscosity method. The results showed that orientin can extrude berberine hydrochloride(BR) from the DNA double helix and cause the decrease of the fluorescence intensity. The main binding force between orientin and DNA is hydrophobic force according to thermodynamic parameters. The binding constantKat 25℃ and 40℃ were calculated as 1.541×103and 1.602×103L·mol-1， and the binding sites numbernas 0.7888 and 0.7242， respectively. The viscosity experiments further proved that orientin binds with DNA in a mode of intercalative binding ．

orientin; DNA; interaction; spectrometry

2014-03-09.

海南省教育厅资助项目(Hjkj2012-22).

1000-1190(2014)04-0528-04

O657.32

A

*E-mail: liuwei1224@126.com.