消化性溃疡合并2型糖尿病患者体内内皮祖细胞的变化

聂志红 李波静

(上海浦东新区公利医院消化科，上海 200135)

近年来，消化性溃疡合并糖尿病的病例逐年增多。与不合并糖尿病的消化性溃疡患者相比，消化性溃疡合并糖尿病患者的溃疡愈合时间较长，复发率较高，出血风险较大，易进展为难治性溃疡[1-2]。本研究分析了消化性溃疡合并2型糖尿病患者的外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)的数量和功能的变化，以期为消化性溃疡合并2型糖尿病的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院2011年1月—2013年12月收治的消化性溃疡合并2型糖尿病患者32例(A组)、消化性溃疡不合并2型糖尿病患者32例(B组)。A组男性18例，女性14例；年龄55～79岁，平均(64.4±6.3)岁。B组男性17例，女性15例；年龄56～79岁，平均(65.1±5.8)岁。两组均除外肿瘤、外周血管病变及消化道出血患者。另选取同期健康志愿者32例作为对照组(C组)，其中男性18例，女性14例；年龄54～78岁，平均(64.8±6.9)岁。3组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组一般资料比较

1.2 诊断标准 消化性溃疡的诊断依据2008年中华医学会消化病学会制定的《消化性溃疡病诊断与治疗规范》[3]，且经胃镜以及病理明确诊断；2型糖尿病的诊断采用2007年中华医学会糖尿病学会制定的《中国2型糖尿病防治指南》[4]。

1.3 测定方法

1.3.1 EPC的定量分析

1.3.1.1 EPC抗体标记 取5.0 mL EDTA钠抗凝外周血，溶解红细胞，加入抗人CD34-PE、CD133-PE-CY5、KDR-APC直标抗体(德国美天生物技术公司)，4℃孵育标记40 min，1000 r/min离心5 min，PBS洗2遍，加入PBS 300 μL。将标记好的细胞转入已含106个荧光微球的测试管(德国美天生物技术公司)，待用。

1.3.1.2 流式分析 开机，预热15 min。进入细胞获取界面。设门，调节参数角散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)、荧光强度探测器1、2、3和4(FL1、FL2、FL3和FL4)等参数，分析2.0×105万个细胞(含荧光微球)，然后用cell quest分析软件分析，获得EPC和荧光微球的比例，再根据荧光微球的已知数量，获得每毫升外周血EPC的绝对数量[5]。

1.3.2 EPC染色 从3组外周血中分离获取单个核细胞并体外培养7 d后，用台酚蓝染色，观察细胞形态。

1.3.3 EPC的功能测定 (1)黏附能力：取5 mL肝素抗凝的外周血，溶解红细胞，加入EPC特异性抗体，用胰蛋白酶消化细胞并收集细胞，加入含胎牛血清的EBM-2[endothelial cell growth medium-2，内皮细胞基础培养基-2；含20%胎牛血清、血管内皮生长因子(VEGF)50 ng/mL、干细胞因子(stem cell factor，SCF) 50 ng/mL，青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL]，计数之后以5×105个/mL接种在人纤维连接蛋白包被的24孔培养板中，37℃培养30 min后，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗未贴壁的细胞后计数贴壁细胞的数量[6]；(2)增殖能力：用(1)中同样方法收集贴壁细胞，以1×105个/mL将EPC接种在人纤维蛋白包被的96孔培养板中，再于每孔中加入10.0 mL MTT(二苯基四氮唑嗅盐，5 g/L)，培养4 h，去除上层清液，加入二甲基亚砜，振荡10 min，用酶标仪检测各孔吸光度(波长490 nm)；(3)迁移能力：收集贴壁细胞，用EBM-2培养基悬浮细胞并计数。将含血管内皮生长因子(VEGF，10 μg/L,英国Peprotee公司)的25.0 mL EBM-2培养液加入改良的Boyden小室下室，然后将含2.0×104个EPC的50.0 mL悬浮液加入上室，培养24 h，刮去滤膜上未移动的细胞后，甲醛固定并用Giemsa染色，于显微镜下随机选取3个视野进行观察，计算迁移到下室底层的细胞的数量。

2 结 果

2.1 荧光显微镜下观察EPC 外周血中分离获取单个核细胞，体外培养7 d后，显微镜下观察发现，细胞呈小杆型与梭型，贴壁，并且细胞连接成条索状的结构(图1)。

2.2 3组外周血中EPC的含量比较 A组外周血中含(39.68±7.58)个/mL EPC，B组为(44.47±11.50)个/mL，C组为(58.42±14.85)个/mL。A、B组EPC的含量均低于C组，A组EPC含量低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 3组EPC的功能比较 A组和B组EPC的黏附、增殖、迁移能力均明显低于C组，A组EPC的黏附、增殖、迁移能力明显低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组EPC的黏附、增殖、迁移能力的比较

3 讨 论

消化性溃疡的形成、愈合、复发与消化道黏膜的血液循环状态密切相关。2型糖尿病患者因糖脂代谢的紊乱常发生消化道黏膜血液循环障碍，消化道毛细血管及毛细血管前小动脉基底膜增厚、血管内皮细胞增生、再生能力下降，消化道黏膜屏障的保护作用减弱，进而导致消化性溃疡的发生[7-8]。研究[9]表明，糖尿病患者因微循环较差，组织细胞再生能力减弱，故消化性溃疡愈合时间长、愈合质量下降。

目前大量研究已经证实EPC是一种多功能干细胞，在特定的条件下能够分化为成熟血管内皮细胞。EPC通常存在于骨髓中，并处于休眠状态，当组织缺血或血管损伤时，被动员到外周血中，进一步分化、增殖、迁移，促进内皮损伤部位的修复和微血管的生成。研究[10-13]发现，外周血EPC与糖尿病的微血管病变有着密切关系，但外周血EPC是否与合并糖尿病的消化性溃疡有关，目前尚未见报道。本研究中分离并培养的EPC细胞镜下呈小杆型与梭型，贴壁，细胞连接成条索状的结构；A组和B组EPC的数量及功能均低于C组；A组EPC数量及功能低于B组；这说明消化性溃疡无论是否合并2型糖尿病，外周血中EPC数量及功能均降低，但合并糖尿病患者EPC的数量及功能下降更显著，提示合并2型糖尿病的消化性溃疡的发生、发展与EPC的分化、增殖、迁移相关。近来研究[13]还发现，黄芪多糖联合EPC可以刺激血管生成，用于治疗糖尿病雄鼠肢端缺血，取得较为理想效果，亦为今后糖尿病合并消化道溃疡的治疗提供了新的思路。

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