Rv0222/ESAT-6融合蛋白对结核病的诊断价值

张慧涨 范齐文 杨华 黄红梅 方强

(1.复旦大学附属金山医院检验科，上海 201508；2.复旦大学附属公共卫生临床中心检验科，上海 201508；3.上海市肺科医院结核病实验室，上海 200433)

目前，结核病仍是人类面临的最严重的传染病之一。近年来，结核分枝杆菌多药耐药菌株(multidrug resistance，MDR)的增多及合并艾滋病等使结核病患者的病死率升高[1]。肺结核患者的诊断主要依据临床表现、影像学检查以及痰涂片查找抗酸杆菌等。痰涂片检查结核分枝杆菌的阳性率偏低；结核分枝杆菌的培养一般需4～8周，阳性率也较低；常用的血清学诊断、结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验等辅助诊断方法也有很多不足。结核分枝杆菌感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB，简称T-SPOT)技术具有高特异度和灵敏度，已被国外广泛应用于结核分枝杆菌潜伏感染的检测[2]。但是，T-SPOT所需血液量较多，且需24 h才能完成。血清抗体检测具有快速、简便、价格低廉、非侵入性等优点，一直是结核病诊断的研究热点。

本研究诱导Rv0222大量表达并纯化，然后将其与ESAT-6结合成融合蛋白，以该融合蛋白为抗原采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清，评价其在临床结核病及HIV合并结核病的早期诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的结核病患者42例(其中肺结核15例，肺外结核27例；男性24例，女性18例)以及HIV合并结核病患者36例(其中男性33例，女性3例)；选择2013年在复旦大学附属金山医院就诊的非结核疾病患者20例(其中乙型肝炎5例、肝硬化4例、肺炎7例、肺气肿2例、尖锐湿疣2例；男性12例，女性8例)以及健康体检者28名(其中男性16名，女性12名，根据临床检测和病史资料，排除心、肝、肾疾病及糖尿病、肿瘤等疾病)，小儿结核抗体阳性者48例(其中单独IgG型38例，IgM和/或IgG型10例；年龄3个月～7岁；男性27名，女性21名)。收集各受试者的血液标本。

1.2 试剂与仪器 pMD18-T载体、聚合酶、内切酶、T4连接酶购自生物工程(大连)有限公司；His-Tag纯化试剂盒购自美国Novagen公司；HRP标记羊抗人二抗购自美国Sigma公司；Taq酶、dNTP、Mg2+、缓冲液购自北京天根生化科技有限公司；结核分枝杆菌H37Rv标准菌株购自上海市肺科医院；T-SPOT试剂盒购自英国Oxford Immunotec公司；结核抗体试剂购自北京健乃喜生物技术有限公司；酶标二抗稀释液、显色液A、显色液B、终止液购自上海荣盛生物药业有限公司。

1.3 PCR引物的设计与合成 Rv0222和早期分泌性靶抗原(early secretory antigenic target,ESAT-6)基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 Rv0222/ESAT-6融合蛋白的引物设计

1.4 基因克隆和鉴定 以H37Rv染色体DNA为模板分别扩增Rv0222和ESAT-6基因片段。Rv0222基因的PCR反应条件：94℃ 7 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃ 7 min。Rv0222基因的扩增产物经试剂盒处理后，装入pMD18-T载体中；将载有Rv0222基因的pMD18-T酶切处理后，再亚克隆到表达载体pET28a，构建重组质粒pET28a-Rv0222。以同样方式克隆ESAT-6基因。ESAT-6基因PCR反应条件：94℃ 7 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃ 7min。构建重组质粒pET28a-Rv0222-ESAT-6，挑选重组克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 重组融合蛋白的收集、纯化和抗原性鉴定 挑重组菌，于含100 mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中过夜培养；再以1∶100接种到1 L的LB培养基中37℃培养，至吸光度(A)值为0.6～0.8；加入β-硫代半乳糖苷至终浓度为1 mmol/L，37℃继续培养4～6 h；超声破菌后用8 mol/L尿素溶解，流过琼脂糖镍柱，得到高纯度的重组蛋白。将纯化变性的蛋白置于半透膜中，在4℃低温磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)中缓慢透析，使变性蛋白完全溶解。留取样品，用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。纯化蛋白全湿转膜，350 mA，45 min。用含5%小牛血清的PBS封闭1 h，与1∶200稀释的结核患者血清的一抗反应l h，充分洗涤后与1∶10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗反应2 h，四甲基联本胺和双氧水等反应显色。

1.6 ELISA 以Rv0222/ESAT-6融合蛋白包被酶标板，采用ELISA检测待测血清。根据棋盘滴定法选择包被抗原浓度为4 μg/mL，每孔100 μL包板，4℃过夜，洗涤后用含1%牛血清白蛋白的PBS封闭1 h。取95 μL样品稀释液，加入Rv0222/ESAT-6抗原预包被板中，取5 μL待检样本加入样品稀释液中吹打混匀(1∶20稀释)，37℃孵育1 h，同时设空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔。浓缩洗液以1∶20用蒸馏水稀释后，加入300 μL/孔，洗板机洗板5次。于各反应孔中，加入用酶标二抗稀释液新鲜稀释的酶标抗体(1∶10000稀释)100 μL。37℃孵育30 min。浓缩洗液以1∶20用蒸馏水稀释后，加入300 μL/孔，洗板机洗板5次。显色液A、B等体积混合后，于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100 μL ，室温避光反应2～5 min。于各反应孔中加入终止液50 μL终止反应。在酶标仪上于450 nm/630 nm处检测各孔OD值，若大于阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行分析，采用χ2检验比较结核患者、非结核患者和健康对照者的抗体阳性检出率，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 T-SPOT检测结果 42例结核患者中24例阳性，36例HIV合并结核患者中18例阳性，共42例阳性。20例非结核患者与28例健康体检者均为阴性。

2.2 42例T-SPOT阳性患者的ELISA检测结果 42例中，36例的ELISA结果为阳性，6例为阴性。ELISA与T-SPOT比较，总的阳性符合率为86%(36/42)，即ELISA的敏感性为86%。

78例结核与HIV合并结核患者的T-SPOT阳性率54%(42/78)，ELISA阳性率46%(36/78)，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 36例T-SPOT阴性的结核患者与HIV合并结核患者的ELISA检测结果 见表2。

表2 36例T-SPOT阴性患者的ELISA检测结果 (n)

ELISA与T-SPOT比较，总的阴性符合率75%(27/36)；36例T-SPOT阴性的患者中9例ELISA阳性，占25%(9/36)；其中有2例培养阳性而T-SPOT阴性的患者ELISA阳性。

2.4 各组的检测结果比较 见表3。

表3 各组的检测结果比较 (n)

结核患者：T-SPOT 阳性率57%(24/42)，ELISA阳性率71%(30/42)，差异有统计学意义(P<0.05)

HIV合并结核患者：T-SPOT阳性率50%(18/36)，ELISA阳性率61%(22/36)，差异无统计学意义(P>0.05)

非结核患者与健康体检者的T-SPOT与ELISA结果均为阴性，表明ELISA的特异性为100%。

2.5 48例小儿结核抗体阳性者的ELISA检测结果 48例小儿结核抗体阳性者中，所有的ELISA结果均为阴性。

3 讨 论

1999年Behr等[3]比较Mtb(H34Rv株)和卡介苗基因组后发现了16个缺失区，RD4区是其中之一。RD区被认为与Mtb的毒性直接相关[4]，是导致卡介苗毒性减弱的主要原因，因此，RD区成为寻找结核病免疫学诊断抗原的方向之一。Rv0222是结核分枝杆菌H37Rv株中RD4位点enoyl-CoA hydratase echA1基因(789bp)编码的蛋白，含262个氨基酸，分子量为27 280.2D，等电点为4.78。Rv0222可能是烯酰辅酶A水合酶，参与脂类代谢。编码Rv0222的基因经研究[5-6]证实不存在于野生型的牛型分枝杆菌和BCG中，故该基因的检测对于排除卡介苗接种者的假阳性较为有利，这与本研究中小儿因接种BCG而结核抗体阳性但ELISA结果均为阴性相符合。ESAT-6基因位于H37Rv菌株中RD1位点，含96个氨基酸，分子量为6000 D，由于ESAT-6仅在致病性分枝杆菌(如人结核分枝杆菌、 牛分枝杆菌、 非洲分枝杆菌、萨斯分枝杆菌、 瘰疬分枝杆菌、 苏尔加分枝杆菌、 微黄分枝杆菌)中表达 ,特异性强；其在所有BCG亚株和非致病分枝杆菌中均不表达。许多研究表明，ESAT-6蛋白具有良好的抗原刺激性并能被大多数结核患者所识别。

根据Rv0222与ESAT-6的生物学特性，预期以Rv0222/ESAT-6融合蛋白作为抗原诊断结核分枝杆菌感染，将会有较高的特异性和敏感性，在结核病的早期诊断上可能有优势。Rosenkrands等[5]对比了Rv0222蛋白与ESAT-6/CFP10融合蛋白(T-SOPT.TB的诊断抗原)对结核感染的诊断效果，二者的敏感性分别为94%、75%。本研究中对于结核患者，ESAT-6/CFP10融合蛋白和Rv0222/ESAT-6融合蛋白诊断结核感染的敏感性分别为57%、71%，证实Rv0222/ESAT-6融合蛋白是血清学诊断结核的一个有前景的抗原靶标。Rosenkrands等[5]发现，Rv0222检测HIV阳性的结核感染者的敏感性(43%)高于HIV阴性的结核感染者(30%)；ESAT-6/CFP10融合蛋白检测这两类人群结核感染的敏感性分别为10%、42%。本研究中，对于HIV阳性的结核患者，Rv0222/ESAT-6融合蛋白和ESAT-6/CFP10融合蛋白的相对检出率分别为61%、50%，这表明Rv0222/ESAT-6融合蛋白对于诊断HIV阳性者的结核感染有较高的敏感性。

综上所述，以Rv0222/ESAT-6融合蛋白作为抗原的ELISA用于诊断结核感染的灵敏度和特异性均较高，同时对于合并HIV感染的结核诊断也有较高的检出率。由于ELISA法具有快速、简便、无需特殊仪器的优点，克服了结核病传统检测方法的检测周期长、步骤繁琐、影响因素多、需特殊仪器等缺点。Rv0222/ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原的ELISA检测在结核病的早期检测、早期诊断方面具有潜在的应用价值。

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