珍稀濒危植物珙桐初代培养研究

植 爽，胡 艳，曹 婧，肖小君,2*，陈文年,2

(1.内江师范学院生命科学学院，四川 内江 641112；2.四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室，四川 内江 641112)

珍稀濒危植物珙桐初代培养研究

植 爽1，胡 艳1，曹 婧1，肖小君1,2*，陈文年1,2

(1.内江师范学院生命科学学院，四川 内江 641112；2.四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室，四川 内江 641112)

以珙桐芽体为试材，采用WPM、1/2 MS、B5三种基本培养基，附加6-BA、NAA、GA34因素3水平正交实验设计，同时研究了不同外植体消毒时间、剥离方式、芽体长度对珙桐初代培养的影响。结果表明：用75%酒精30 s+0.1% HgCl220 min消毒效果较好，外植体长度大于0.5 cm，剥离芽体至剩余鳞片叶1～2个的处理方式有利于降低污染率，最佳芽诱导的培养基配方为：WPM+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L + AC 0.5 g/L。

珙桐；诱导；外植体；初代培养

珙桐(DavidainvolucrataBaill.)，又名鸽子树，为我国特有的珍稀孑遗植物，被列为国家Ⅰ级濒危保护植物，具有极高的观赏价值和研究价值[1]。然而，珙桐的种子壳厚而坚硬，有后熟现象，休眠期长，发芽率低，繁殖和引种困难，所以至今未成为广泛应用的园林绿化树种[2]。近年来由于人类活动对自然环境的影响，珙桐的生态环境遭到了严重破坏，导致其个体数量逐渐减少，分布范围也日益缩小，因此挽救和保护珙桐并扩大其数量迫在眉睫。采用组织培养技术进行珙桐再生体系的建立可为保护珙桐种质资源提供一条新途径，目前关于这方面的研究主要集中在愈伤组织的诱导[3-5]，种胚离体培养[6-8]，带芽茎段[9-10]或冬芽[11]诱导丛生芽增殖，总的来说有关珙桐植株再生的文献报道较少，且进展缓慢，初代培养的重复性差。为此，本试验对外植体不同消毒时间、剥离方式、芽体长度、激素配比和基本培养基的筛选等方面做了系统研究，有效降低了外植体的污染率，为珙桐高效离体再生体系的建立提供初代培养的理论依据，以期最终为珙桐的工厂化生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2013年7月，在四川省宜宾市珙县选取当年生枝条上未萌发的芽体作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 基本培养基及激素质量浓度的筛选 本试验采用L9(34)正交试验设计(见表1)，基本培养基为WPM、1/2 MS、B5，附加细胞分裂素6-BA 3水平分别为1.0，2.0，3.0 mg/L，生长素NAA 3水平分别为0.05，0.1，0.2 mg/L，赤霉素GA33水平分别为0，2.0，5.0 mg/L。其中含蔗糖30 g/L，琼脂粉4.6 g/L，活性炭0.5 g/L，调节pH值为5.8～6.0，高压灭菌20 min( 121 ℃) 后备用。

将珙桐芽放在洗衣粉溶液中浸泡2 min，用干净的白纱布轻轻将芽鳞擦干净，再在流水下冲洗2 h后在超净工作台上先用75%的酒精溶液浸泡20 s，经无菌水冲洗3次，再用0.1%HgCl2溶液浸泡15 min，经无菌水冲洗5～6次。用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，剥去全部芽鳞片，留绒状未展开叶2～3片，去除与茎连接处的木质部接入培养基，选取芽诱导率最高的培养基配方用于以下试验。

1.2.2 外植体不同消毒时间、剥离方式及长度对珙桐芽体萌发的影响 在基本培养基及激素质量浓度的筛选基础上，设置外植体消毒时间分别为75%酒精30 s+0.1% HgCl2(10，20，30 min)；剥离方式分别为：①不剥芽鳞片，②剥去部分与消毒液接触的芽鳞片，③将芽鳞片全部剥掉，剩绒状叶2～3个；外植体长度分别为①d>1 cm，②0.5 cm

1.3 培养条件

将接种后的材料置于培养室内，先暗处理2 d，此后每日光照14 h，光照度为2 000 lx，温度控制在(25±2) ℃，以上每个处理均接种10管，重复3次。

1.4 统计分析

定期观察外植体污染、褐化、萌发及芽的生长情况并记录数据，数据采用SPSS 13.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基及激素质量浓度对珙桐芽诱导的影响

从结果(见表1)可以看出，基本培养基及激素质量浓度对珙桐芽诱导有明显影响。WPM与1/2 MS明显优于B5培养基，低质量浓度的6-BA及 NAA效果好于高质量浓度，GA3质量浓度越高芽体启动越早，生长速度越快，邹利娟等[11]研究表明在培养中适当添加GA3能促进芽苗生长，叶片扩大，缩短培养时间。但本试验研究发现GA3对芽体长势影响较大，在GA3的作用下，随着培养时间延长，芽的生长更容易发生畸形化，且质量浓度越高，畸形化程度越严重，出现披针形叶，叶片颜色出现红色或紫红色。观察发现30 d后未添加GA3的培养基中新生叶片广卵圆形，绿色，完全展开且长势旺盛。直观分析结果表明：4种因素的极差(R值)大小依次是C>A>B>D，因此4种因素对珙桐芽体萌发的影响大小依次是NAA>基本培养基>6-BA>GA3，从均值(K)可以看出，使用WPM培养基配合低质量浓度的6-BA及 NAA有利于珙桐的芽诱导，即最佳配方为WPM+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L+AC 0.5 g/L。

表1 珙桐芽诱导正交试验结果及直观分析

“+”表示叶片完全卷曲;“++” 表示叶片较为卷曲;“+++”表示叶片完全舒展开。

2.2 外植体不同消毒时间对珙桐芽体萌发的影响

从结果(见表2)可知，用75%酒精与0.1%HgCl2的不同消毒时间处理外植体的效果差异显著，其中75%酒精30 s+0.1%HgCl210 min的污染率最高达96.67%，且芽一直未萌发，随着HgCl2溶液浸泡时间的加长，污染率有所降低，但处理30 min外植体受消毒剂毒害作用加大，表现为芽生长速度缓慢且长势差，而处理20 min的珙桐芽启动早，20 d即可观察到外植体开始长出新叶片，且叶片深绿色，长势好，芽诱导率最高达76.92%。

表2 外植体不同消毒时间对珙桐芽体萌发的影响

同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 不同外植体剥离方式对珙桐芽体萌发的影响

从结果(见表3)可以看出，不同的剥离方式对珙桐芽的成功诱导有显著影响。未经任何处理的芽体几乎全部污染，剩余鳞片1～2个与剩绒叶状1～2个剥离方式的污染率和诱导率均存在显著差异，观察发现后者芽启动早，10 d后即长出新叶片，生长情况良好，但污染率较前者高出36.67%。综合试验结果，分析认为剩余鳞片1～2个的剥离方式有利于珙桐芽体萌发，25 d左右可见新叶片长出，且污染率最低，诱导率高达78.26%。

2.4 不同外植体长度对珙桐芽体萌发的影响

从结果(见表4)可以看出，外植体长度d<0.5 cm时，珙桐的芽诱导率为0，且污染率高达90%，分析认为由于外植体太小，剥离比较困难，在空气中操作时间较长，从而引起污染，且芽体太小不易成活。当d>0.5 cm时，污染率显著降低，诱导率最高达75%，外植体越大，新叶片展开速度越快，芽体长势好，启动快。

表3 不同外植体剥离方式对珙桐芽体萌发的影响

同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表4 不同外植体大小对珙桐芽体萌发的影响

同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

3.1 外植体的选择及处理方式对珙桐芽诱导的影响

珙桐为多年生木本植物，母株带菌多，污染严重，取材困难，外植体的遗传和生理差异使初次培养的可重复性降低，初次培养的严重污染及酚类物质的氧化使培养难以进行[12]。在组织培养中，外植体的选择及处理是组织培养能否成功的第1步[13]。综合本试验研究结果认为，用75%酒精30 s+0.1%HgCl2处理20 min消毒效果较好，常规灭菌剂在材料表面消毒的同时对植物组织往往亦有伤害，0.1%HgCl2处理30 min后对珙桐污染率可以有效控制，但诱导率显著下降，且芽体受伤害严重，表现为启动慢，死亡率高，而处理10 min的污染率较高，未达到消毒效果。选取外植体长度大于0.5 cm且剥离芽体至剩余鳞片叶1～2个的处理方式有利于控制污染，这可能是因为外植体较大，在剥离与消毒剂接触的芽鳞片时操作较容易，技术更熟练，减少了外植体在空气中的暴露机会，从而降低了污染率。

3.2 基本培养基及激素质量浓度对珙桐芽诱导的影响

在植物组织培养中，培养基中的盐浓度对外植体褐变和试管苗玻璃化均有一定影响[14]。本试验研究认为，珙桐的初代培养中选用WPM和1/2MS培养基效果较好，这与大多数学者的研究结果一致[4,15]，符合多数木本植物在诱导阶段采用较低无机盐浓度的结论。而B5培养基由于含有高浓度的硝态氮和低浓度的钙盐，可能会抑制珙桐的芽诱导。

植物激素的种类、质量浓度和配比对组织培养的器官形成起着重要的作用。本试验研究表明，各种激素的影响力大小依次为NAA>6-BA>GA3，这可能由于本试验采取材料的时间为夏季，珙桐芽体未进入休眠状态，用低质量浓度的生长素NAA和细胞分裂素6-BA即可促进芽体萌发生长，同时观察发现GA3能促进芽体提早启动并伸长生长，但随着质量浓度的增加，畸形化形象严重，变异增多，这可能与激素物质抑制过氧化氢酶和过氧化物酶的活性或抑制糖酵解过程有关[16]。因此，在珙桐的初代培养过程中，GA3的最佳促进芽萌发质量浓度还需进一步研究。综合试验结果认为WPM+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L+AC 0.5 g/L，为珙桐组织培养芽诱导最佳培养基。

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InitialculturestudyofendangeredplantDavidiainvolucrataBaill.invitromicropropagation

ZHI Shuang1, HU Yan1, CAO Jing1, XIAO Xiao-jun1,2*, CHEN Wen-nian1,2

(1.School of Life Sciences, Neijiang Normal University, Neijiang 641112,China; 2.Key Laboratory of Colleges and Universities in Sichuan for Research and Utilization of Distinctive Agricultural Undertakings, Neijiang 641112,China)

Using basal medium of WPM,1/2MS and B5 which added 6-BA,NAA and GA3, the time of different explant disinfection, the way of stripping and the length of buds ofDavidiainvolucratawere studied.The results showed that the disinfection effect was appropriate by adopting 75% alcohol for 30 and 0.1% HgCl2for 20 min, it was good for reducing pollution to us the explants which were more than 0.5 cm and the stripping way to the rest 1 to 2 scale leaves.And the best medium for buds induction was WPM+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L + AC 0.5 g/L.

DavidiainvolucrataBaill.;Induction;Explant; Initial culture

1001-7380(2014)04-0029-04

2014-05-03

国家级大学生创新创业训练计划项目(201310640010)；内江师范学院校级重点项目(12NJZ04)；内江市科技支撑计划项目(12109)；内江师范学院大学生科研项目(13NSD-76)

植 爽(1992-)，女，四川都江堰人，大学本科毕业，研究方向：植物组织培养。

*通信作者：肖小君(1982- )，女，四川岳池人，助理研究员，硕士，研究方向：植物组织培养及生理生化。

S792.99；Q943.1

A

10.3969/j.issn.1001-7380.2014.04.007