联合血清肿瘤标志物建立预测厄洛替尼治疗复治非小细胞肺癌生存模型

邵岚 洪卫 郑蕾 何春晓 张贝贝 谢发君 宋正波 娄广媛 张沂平

目前，癌症是全球疾病死亡的主要原因之一。据统计，2008年全世界因癌症死亡的有760万人，约占所有死亡人数的13%。其中，肺癌发生率最高，达到了137万例左右[1]。在我国，据《2012中国肿瘤登记年报》报道，2009年全国肿瘤的发病率为285.91/10万，肺癌占恶性肿瘤发病的第一位（约54/10万），死亡率也居首位（约46/10万）[2]。肺癌中大约80%是非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC），预后较差，5年生存率仅为16%左右，且超过40%-50%的NSCLC患者在发现时已是晚期[3]，失去了手术的机会，化疗是其治疗的主要手段之一。传统的两药联合方案化疗缓解率为30%左右，中位生存时间仅8个月-11个月[4]。2004年，随着表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）药物的问世，使EGFR基因突变肺癌患者的肿瘤缓解率提高到了60%左右，总体生存时间也达到了20多个月[5,6]。厄洛替尼（特罗凯，Tarceva）是第一代可逆EGFR-TKI，BR.21[7]、TRUST[8]、TITAN[9]等研究逐步奠定了厄洛替尼在晚期NSCLC的二、三线治疗中的重要地位。

尽管靶向药物的治疗带来了更好的疗效和生存获益，但基因状态相同的患者也在疗效、有效时间和毒副反应方面存在差异。BR.21研究中发现与有效率高相关的指标有：女性、腺癌、亚裔人、不吸烟、EGFR蛋白表达阳性大于10%。多因素分析发现腺癌、亚裔人及不吸烟的患者生存期较长。已有学者利用临床因素和其他分子标志物筛选有意义的指标，并建立预后预测模型，为临床个体化治疗提供更多更便利的指导[10-12]。

目前临床上广泛开展的EGFR基因突变的检测方法，如直接测序法、焦磷酸测序法及ARMS法等都必须通过肿瘤组织检测，然而很多晚期肿瘤患者难以获得足量检测的肿瘤组织，从而限制了其个体化治疗的开展。临床上外周血的采集比较方便，尤其血清肿瘤标记物是目前研究的热门，我们希望能够通过有效的血清肿瘤标记物的检测来找到靶向药物疗效预测指标。目前已经有单中心研究观察了血清肺表面活性物质相关蛋白（pulmonary surfactant-associated protein D, SP-D）、转化生长因子-α（transforming growthfactor α, TGF-α）、基质金属蛋白-9（matrix metalloproteinase 9, MMP-9）、组织多肽特异性抗原（tissue polypeptide specific antigen, TPS）、肺腺癌相关抗原（Krebs von den Lungen-6, KL-6）等是其中一项标记的阳性预测价值，且有些是仅基于国外人群的研究，但未见这些标记观察的联合研究，更未见基于国内人群的联合观察研究。

基于此，我们检测了114例晚期复治NSCLC患者厄洛替尼治疗前外周血中以上五种血清肿瘤标志物水平，同步收集性别、吸烟史、体力状况评分、病理类型、治疗后有无皮疹、转移部位、既往化疗方案数目及疗效等临床资料，常规血液检测指标如血红蛋白（hemoglobin,Hb）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）、C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）、细胞角蛋白19片段（Cytokerantin-19-fragment, CYFRA21-1）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）水平等，分析这些因素与有效率（response rate, RR）、疾病控制率（rdisease control rate, DCR）及预后等的关系，并建立应用厄洛替尼治疗复治晚期NSCLC患者的疗效预测模型，为肺癌个体化治疗道路的探索提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2008年7月-2012年9月在浙江省肿瘤医院化疗科接受厄洛替尼治疗的IIIb期或IV期复治NSCLC患者共114例。符合标准患者告知详情并签署知情同意书，入选患者在厄洛替尼治疗前1周内空腹采取静脉全血2 mL，置入促凝管，离心3,000 rpm，10 min，收集血清，分装后置于-80oC超低温冰箱保存备测。

1.2 外周血清肿瘤标志物检测 SP-D、TGF-α、MMP-9、KL-6、TPS均采用采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）检测，利用Curve Expert 1.4软件绘制各血清肿瘤标志物的标准曲线图，再算出每个样本对应的浓度值。

1.3 治疗 所有患者均接受厄洛替尼（特罗凯，Tarceval，上海罗氏制药有限公司）单药治疗，口服，150 mg/d，允许减量2次，最低剂量50 mg/d。

1.4 近期疗效评价 所有患者接受厄洛替尼治疗4周复查评估近期疗效，对于疗效稳定或有效的患者，8周复查确定疗效，此后每2个月复查1次CT及进行其他影像学检查。疗效评价采用实体瘤疗效评价标准（Response Evaluation Ccriteria in Solid Tumors, RECIST）1.1[13]评价近期疗效，分为完全缓解（complete response, CR）、部分缓解（partial response, PR）、疾病稳定（stable disease, SD）和疾病进展（progressive disease, PD）。近期有效率RR＝（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）×100%。疾病控制率DCR＝（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）×100%。

1.5 随访和生存分析 以首次用药起始时间为起点，疾病进展时间或任何原因死亡作为终点记录患者无疾病进展生存期（progression-free survival, PFS），对于在随访截止日期无进展的病例，在统计时作为删失数据处理。随访采用门诊随访或电话方式，末次随访时间为2013年2月。

1.6 不良反应评定 不良反应按照NCI-CTC 3.0 “抗癌药物常见毒性反应分级标准”，分为0度-4度。

1.7 统计学分析 统计软件采用SPSS PASW 18.0。MMP-9、KL-6、TPS、SP-D、TGF-α与年龄、性别、吸烟史、病理类型、肿瘤临床病理分期、化疗方案等因素的关联分析采用卡方检验。所有统计均采用双侧检验。PFS采用Kaplan-Meier法及Cox比例风险模型进行预后分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料特点 114例入选患者的一般情况：中位年龄55岁（25岁-82岁），＜65岁患者比例较多（79.8%），91例，≥65岁23例；男性77例，女性37例；不吸烟与吸烟的患者比例接近（50.9% vs 49.1%）；体能状态（performance status, PS）评分0分-1分有83人，占72.8%，PS评分2分-3分占27.2%；病理类型主要分成两大类：腺癌69例，非腺癌45例；31.6%的患者明确了EGFR基因状态，其中突变23例，野生型13例；疾病分期以IV期为主，104例（91.2%），IIIb期10例（8.8%）；末次化疗疗效为CR/PR/SD的患者为99例（86.8），PD患者15例（13.2%）；既往只接受过一种化疗方案的患者64例（56.1%），≥2种化疗方案50例（43.9%）。详见表1。

2.2 疗效反应 在114例接受厄洛替尼治疗的患者中，有1例患者获得CR，25例患者达到PR，总体RR为22.8%（26/114），DCR为72.8%（83/114）。

将各个临床因素进行分层，在RR方面：PS评分0分-1分的患者RR要高于PS评分2分-3分的患者（27.7% vs 9.7%, P=0.041）；病理类型是腺癌的患者有效率要高于非腺癌的患者（30.4% vs 11.1%, P=0.016）；EGFR基因突变的患者RR明显高于野生型和基因状态未知的患者（47.6% vs 0 vs 20.5%, P=0.002）；末次化疗疗效获得疾病控制的（即疗效为CR/PR/SD）的患者RR明显高于末次化疗疗效PD的患者（26.3% vs 0, P=0.024）；在厄洛替尼治疗期间出现皮疹的患者RR高于无皮疹的患者（30.1% vs 9.8%, P=0.013）。

在DCR方面：其中既往不吸烟的患者DCR要高于有吸烟史的患者（71.0% vs 64.3%, P=0.045）；病理类型是腺癌的患者DCR高于非腺癌的患者（81.2% vs 60.0%, P=0.013）；EGFR基因突变的患者DCR明显高于野生型、基因状态未知的患者（90.5% vs 33.3% vs 75.6%,P＜0.001）；末次化疗疗效获得疾病控制的（即疗效为CR/PR/SD）的患者DCR明显高于末次化疗疗效PD的患者（79.8% vs 26.7%, P＜0.001）；在厄洛替尼治疗期间出现皮疹的患者DCR高于无皮疹的患者（80.8% vs 58.5%,P=0.010）。

2.3 实验室常规检测指标与疗效的关系 同步收集114例患者厄洛替尼治疗前1周内实验室常规检测指标：Hb、ALP、LDH、CRP、CYFRA21-1、CEA，根据正常值范围分别分成正常组和异常组。分析其与厄洛替尼治疗疗效的关系，Hb正常组RR和DCR均高于异常组（32.9%vs 4.9%, P＜0.001）（82.2% vs 56.1%, P=0.003），差异有统计学意义。LDH正常组DCR高于异常组（79.0% vs 57.6%,P=0.020）。

2.4 血清肿瘤标志物与疗效的关系 114例患者厄洛替尼治疗前血清肿瘤标志物水平检测结果详见表2。为了便于进一步与疗效及预后的分析，将患者每个血清肿瘤标志物按水平情况分成两组。通过查阅相关文献， SP-D的截点定为110 ng/mL[14]，TGF-α截点为12 pg/mL[15]，TPS截点为80 U/L[16]，MMP-9和KL-6分别以中位值定为截点（535 ng/mL, 332 U/mL）。

分析5项血清肿瘤标志物与患者厄洛替尼治疗疗效的关系发现，SP-D＞110 ng/mL组的RR及DCR均高于≤110 ng/mL组，RR分别是33.3%和13.3%（P=0.011），DCR分别是83.3%和63.3%（P=0.017）。MMP-9≤535 ng/mL的DCR要明显高于＞535 ng/mL组（83.9% vs 62.1%,P=0.009）。 TPS的＜80 U/L组的DCR要高于≥80 U/L组（P=0.002）。TGF-α和KL-6组间的RR和DCR均没有统计学差异。

2.5 预后分析 114例晚期NSCLC复治患者接受厄洛替尼治疗的中位PFS是5.13个月（95%CI: 3.49-6.77），见图1。1年生存率为69.3%。

通过Kaplan-Meier分析发现既往不吸烟的患者较吸烟患者mPFS明显延长（5.23个月 vs 3.95个月，P=0.028）。病理类型为腺癌较非腺癌患者可获得较长的mPFS（5.95个月 vs 3.25个月，P=0.002）。EGFR基因突变组mPFS可达15.8个月，明显长于野生组和未知组，野生组最短，仅1.03个月（P＜0.001）。末次化疗疗效获得疾病控制的患者较进展的患者mPFS长（5.82个月vs 1.03个月，P＜0.001）。在厄洛替尼治疗期间出现皮疹的患者较无皮疹的患者mPFS也要长（5.60个月 vs 3.25个月，P=0.014）。在厄洛替尼治疗前1周内Hb检测值正常的患者较异常的患者mPFS长（5.83个月 vs 1.72个月，P=0.001）。LDH正常的mPFS长（5.98个月 vs 3.47个月，P=0.001）。CRP正常的也较异常的患者获得较长的mPFS（5.82个月 vs 2.07个月，P=0.010）。

表1 114例IIIb/IV期复治非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者的临床特征Tab 1 The clinical characteristics of 114 patients with stage IIIb/IV lung cancer failed to chemotherapy chemotherapy

表2 114例IIIb/IV期肺癌患者血清肿瘤标志物水平Tab 2 The serum levels of tumor biomarkers in the patients with stage IIIb/IV lung cancer

进一步分析检测的5项血清肿瘤标志物与患者厄洛替尼治疗mPFS的关系发现，SP-D＞110 ng/mL组的mPFS要长于≤110 ng/mL组（5.95个月 vs 3.25个月，P=0.009），见图2A。TGF-α两组间mPFS无明显统计学差异（5.6个月 vs 4.07个月，P=0.579），见图2B。MMP-9≤535 ng/mL的mPFS要长于＞535 ng/mL组（5.83个月 vs 3.47个月，P=0.046），见图2C。 KL-6中＜500 U/mL组要优于≥500 U/mL组（6.03个月 vs 3.40个月，P=0.040），见图2D。TPS的＜80 U/L组mPFS要明显长于≥80 U/L组（6.15个月 vs 2.42个月，P=0.014），见图2E。

经Cox回归多因素分析5种血清肿瘤标志物与PFS的影响发现，SP-D（HR=1.865, 95%CI: 1.14-3.04, P=0.013）和TPS（HR=1.698, 95%CI: 1.03-2.79, P=0.037）是PFS的独立影响因素，见表3。

表3 厄洛替尼治疗114例复发性非小细胞肺癌患者血清肿瘤标志物与PFS的多因素分析Tab 3 Multivariate analysis of PFS and serum tumor markers in the 114 recurrent lung cancer patients treated with Erlotinib

图1 114例厄洛替尼治疗患者PFS曲线Fig 1 The PFS curves of 114 IIIb/IV lung cancer patients received erlotinib treatment

2.6 毒性反应 114例患者厄洛替尼治疗常见的不良反应是皮疹（64%）和腹泻（51.8%），1度较多，3度患者一般经过短期（不超过1周）的停药后症状可改善，有2例患者因反复3度皮疹后厄洛替尼减量至100 mg每天1次。有2例患者出现间质性肺炎，1例为1度，经暂停药物，抗生素和激素治疗后肺炎消失，继续厄洛替尼治疗后未再出现间质性肺炎。其中1例为2度间质性肺炎，并伴有气急、胸膜、咳嗽等症状加重情况，考虑患者年纪较大（＞75岁），经治疗肺炎消失后，家属停止了厄洛替尼治疗。其他常见不良反应如食欲下降、乏力、白细胞降低、肝功能损害的患者，经对症治疗后改善或恢复正常。详见表4。

3 预测模型构建

选择单因素分析筛选出的影响PFS的12项变量作为观察指标，包括吸烟史、病理类型、EGFR基因突变状态、PS评分、末次化疗疗效、皮疹、Hb、LDH、SP-D、TPS、MMP-9、KL-6，进一步筛选出PFS的独立影响因素，将12项观察指标进行赋值，见表5。应用Cox比例风险模型进行多因素分析，构建预测模型并验证，随后计算每个患者的个体预后指数（personal prognosis index,PI），并根据PI值进行预后分组，比较各组的PFS情况。以P≤0.05为差异有统计学意义。

将12项观察指标应用Cox比例风险模型进行多因素分析，最后筛选出6项影响PFS有统计学意义的指标：吸烟史、EGFR基因状态、末次化疗疗效、皮疹、LDH、TPS。见表6。

根据表6的结果，利用Cox比例风险回归模型方法构建厄洛替尼治疗PFS预测模型：H (t, X) = h0 (t)exp (0.622X1 + 0.561X4 + 1.441X5 + 0.793X6 + 0.933X8 +0.778X12)。

预 后 指 数：

图2 厄洛替尼治疗114例晚期复治NSCLC患者5种血清肿瘤标志物与PFS的关系。A：SP-D；B：TGF-α；C：MMP-9；D：KL-6；E：TPS。Fig 2 The relationship among serum tumor markers and PFS in the 114 patients with recurrent non-small cell lung cancer treated with Erlotinib as second line therapy. A: SP-D; B: TGF-α; C: MMP-9; D: KL-6; E:TPS.

PI＝β0 + 0.622X1 + 0.561X4 + 1.441X5 + 0.793X6 +0.933X8 + 0.778X12 。

β0 = -(0.622X(——)1 + 0.561X(——)4 + 1.441X(——)5+ 0.793X(——)6 + 0.933X(——)8 + 0.778X(——)12)

= - 6.671。

将114例患者的PI值排序后，分别以PI值的25%、50%及75%位数作为截点，划分为低危组（≤-0.7538）、中低危组（＞-0.7538且≤-0.2500）、中危组（＞-0.2500且≤0.6150）及高危组（＞0.6150）。将114例患者分成4组后，进一步验证预测模型（表7，图3）。

4 讨论

近年来，随着基因组、蛋白组学的发展和大量靶向药物的研究和应用，肺癌的治疗已经从传统的标准化治疗模式逐渐走上了以基因、蛋白为导向的个体化治疗的道路。第一代EGFR-TKI药物的出现不但为部分肺癌患者，特别是EGFR基因突变型患者带来了明显的生存获益和生活质量的改善，也加速了肺癌个体化治疗不断细化、不断完善的步伐。寻找新的靶点、新的肿瘤标志物也成为了当今肺癌治疗的热点，多个标志物或靶点的联合检测、联合治疗也是目前研究的方向之一。

厄洛替尼属于喹唑啉家族复合物，为可逆的ATP竞争性抑制剂。目前在临床上广泛的应用于EGFR基因19、21外显子突变的肺癌患者，其最常见不良反应为皮疹和腹泻，最严重的毒副作用为间质性肺炎。本研究共纳入114例IIIb期或IV期复治NSCLC患者接受厄洛替尼治疗，同时检测其治疗前外周血中TPS、TGF-α、SP-D、MMP-9和KL-6的水平，分析这5项血清肿瘤标志物、临床因素等与厄洛替尼治疗疗效及预后的关系。我们将5项指标进行了联合多因素分析，发现SP-D（HR=1.865, 95%CI:1.14-3.04, P=0.013）和TPS（HR=1.698, 95%CI: 1.03-2.79,P=0.037）是影响晚期复治NSCLC患者厄洛替尼治疗PFS的独立影响因子，提示SP-D＞110 ng/mL和TPS＜80 U/L的患者可以获得较长的PFS。

表4 厄洛替尼治疗114例晚期复治NSCLC肺癌患者的不良反应Tab 4 The side effects of Erlotinib as second line treatment for 114 patient with recurrent non-small cell lung cancer

表5 114例患者12项观察指标赋值表Tab 5 12 indexes of 114 patients with recurrent non-small cell lung cancer

表6 Cox多因素分析结果（逐步回归模型，Enter P≤0.05，Removal P＞0.10）Tab 6 Multivariate analysis of PFS (step by step regression model, Enter P≤0.05，Removal P＞0.10)

表7 114例患者各风险组PFS情况Tab 7 PFS of 4 risk groups according to the prognostic model

图3 4组血清肿瘤标志物预测模型的PFS比较Fig 3 Comparison of PFS among the 4 predictive models of serum tumor markers.

本研究中114例患者接受厄洛替尼治疗总的RR为22.8%，DCR为72.8%。中位PFS为5.13个月，中位OS尚未达到。患者PS评分0分-1分、腺癌、EGFR基因突变、末次化疗疗效获得疾病控制的（即疗效为CR/PR/SD）、Hb正常、在厄洛替尼治疗期间出现皮疹的患者有效率更高。既往不吸烟、腺癌、EGFR基因突变、末次化疗疗效疾病控制的和有皮疹的患者可以获得更高的稳定率。在PFS方面提示既往不吸烟（P=0.028）、腺癌（P=0.002）、EGFR基因突变（P＜0.001）、末次化疗疗效获得疾病控制的（P＜0.001）、有皮疹（P=0.014）、LDH正常（P=0.001）和CRP正常（P=0.010）的患者PFS较长。

虽然厄洛替尼比传统的细胞毒化疗药物毒副反应小，治疗方便，但并不适用所有的肺癌患者，EGFR基因突变人群是治疗有效的靶点优势人群，RR可达70%以上[17,18]，但如果是野生型患者RR则不足20%[19]，还不如化疗疗效佳。但临床上很多病例往往因肿瘤组织量太少而使EGFR基因检测受到限制。因此，如何尽可能挑选治疗有效的人群，避免盲目用药，使肿瘤治疗更具个体化成为医生和患者共同关注的问题。尽管目前已经有少量基于临床特征的预测厄洛替尼治疗NSCLC疗效的模型报道，但方法和结论也并不一致。

Florescu等[10]以BR.21研究人群为基础分析，提出了预测厄洛替尼治疗疗效的10项指标与OS相关，即吸烟史、PS评分、体重下降是否大于5%、是否贫血、是否乳酸脱氢酶升高、既往化疗方案的疗效、距离确诊肺癌的时间长短、既往化疗方案数、EGFR基因拷贝数和人种。根据每项临床因素的指数计算患者的预后指数，按预后指数将患者分成低危组、中低危组、中高危组和高危组。然后按照不同风险组，组内比较厄洛替尼治疗和安慰剂治疗的生存时间，最后发现低危组和中低危组内厄洛替尼治疗较安慰剂OS明显延长（P＜0.001, P=0.03），中高危组和高危组内厄洛替尼治疗和安慰剂治疗OS没有明显差别。由此得出结论，处于低危组和中低危组的患者可以更好地从厄洛替尼治疗中获益。

国内学者[20]将Florescu的预测模型用在中国人群中进行了检验，回顾性分析了119例接受吉非替尼治疗的晚期复治NSCLC患者，危险因素选取了10项因素中的8项（回顾性分析EGFR基因拷贝数和LDH水平资料不详），分成同样的4组，但因高危组仅3人，因此将中高危和高危组合并为一组。OS结果显示低危组未达到，低中危组8.9个月，中高危/高危组4.5个月。低危组OS明显优于其余两组（P=0.000,3, P=0.000,1），但低中危组和中高危/高危组之间的差异不具统计学意义（P=0.148）。造成结果的差异可能与人种不同， EGFR基因状态未纳入分析等有关，EGFR基因突变在亚裔人群中发生率要明显高于高加索人群[21]，EGFR基因突变状态[22-24]和拷贝数[25]是影响靶向治疗疗效和预后的重要因素。

Park等[11]将272例吉非替尼治疗肺癌患者进行多因素分析，筛选出PS评分2分-3分、腹腔内转移、ALP升高、从诊断到开始吉非替尼治疗≤12个月、白蛋白降低、之前化疗PFS≤12周、WBC＞10×109/L和吸烟史这8项OS不良的预后风险因素。根据风险因素的个数进行分组，0-1个为预后良好组，2个-3个为预后中等组，4个-5个为预后差组，＞6个是预后极差组，mOS分别为18.0个月、11.2个月、4.0个月、1.3个月（P＜0.001）。

韩国Kim等[12]研究的模型跟Park的模型类似，通过研究257例特罗凯化疗的晚期NSCLC患者，筛选出具备以下一项与总生存时间较短相关，即：PS评分2分或以上、LDH升高及治疗后无皮疹，根据风险因素的个数：0个、1个、2个及3个分别为预后好、预后中等、预后差和预后极差4个组，每组中位OS分别为：22.0个月、9.3个月、5.4个月、2.7个月（P＜0.001）。具备以下一项与PFS短相关，即：腹腔内转移、接受过2个或以上方案化疗、治疗后无皮疹，同样根据风险因子个数分为4个组：预后好、预后中等、预后差和预后极差，中位PFS分别为：6.5个月、3.0个月、1.2个月、0.9个月（P＜0.001）。这种预测模型临床上使用较为方便，但每种风险因素的影响因子并不相同，仅以风险个数的多少来评定预后还是会出现偏移的情况，风险评定的准确性有待商榷。

我们在研究时先用单因素分析筛选影响厄洛替尼治疗PFS的因素，包括吸烟史、病理类型、EGFR基因突变状态、PS评分、末次化疗疗效、皮疹、Hb、LDH、SP-D、TPS、MMP-9、KL-6，再用Logistic回归对敏感因素进行多因素分析，筛选出吸烟史、EGFR基因状态、末次化疗疗效、皮疹、LDH、TPS这六个PFS的独立影响因素。利用Cox比例风险回归模型方法构建厄洛替尼治疗PFS预测模型，将114例患者的PI值排序后，分别以PI值的25%、50%及75%位数作为截点，划分为低危组、中低危组、中危组及高危组，mPFS分别为9.12个月、6.88个月、3.52个月、0.93个月（P＜0.001）。我们建模时利用Cox模型法可以细化每项因素的权重值，在分析结果时可以做到更个体化，也更准确。缺点就是在临床实践中相对不够直观，不太便利，在今后的下一步研究中我们会进一步完善，扩大样本量，在准确和便利中寻找合适的平衡点。另外，还需在更大的人群中进一步验证模型的准确性。