膜条酶联免疫法检测特异性IgE抗体的比对分析

彭洁雅 孙宝清 郑佩燕

膜条酶联免疫法检测特异性IgE抗体的比对分析

彭洁雅 孙宝清 郑佩燕

目的 比较酶联免疫快速膜条法与荧光酶联免疫测定法(unicap法)对9种常见血清特异性IgE抗体检测结果的吻合度, 以及该膜条法按照仪器操作和手工操作结果的一致性比较, 从而验证膜条法作为半定量检测sIgE抗体的有效性。方法 收集来自临床科室标本80份, 用仪器和手工方法同时对10种物质进行sIgE检测, 分析两种不同操作方法所得结果；另外选取部分标本同时用膜条法仪器测定和unicap法对9种常见血清特异性IgE抗体进行检测分析。结果 两种实验方法定性结果符合率较理想, 对于大部分检测项目, 两种操作方法定性结果一致性高。结论 HOB膜条法操作简捷, 检测成本低, 是一种值得推广的定性检测血清变应原特异性IgE抗体的方法。

过敏原；特异性IgE; HOB膜条

过敏性疾病是一种常见病, 通常认为, IgE是导致I型过敏反应的主要抗体, 通过检测患者血清过敏原特异性IgE(sIgE),可明确患者的过敏原, 对于疾病的诊断﹑指导预防和治疗均具重要意义［1］。CAP变应原检测系统, 已在国内外广泛应用,但其所需样本量大, 检测成本高, 局限了其作为初筛检测常规方法的推广［2］。本研究旨在探讨HOB膜条试验法与unicap法检测结果的一致性, 分析膜条法临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为广州医科大学附属第一医院2013年1～5月就诊于变态反应科和儿科门诊有过敏性反应特征的患者80例, 临床症状主要包括哮喘﹑过敏性鼻炎﹑荨麻疹。其中男性38例, 女性42例, 年龄3～78岁, 平均23.0岁。

1.2 方法和原理 患者分别采集静脉血5 ml, 全部血液分离血清后, 移至 EP 管, -20℃保存待测。sIgE测定采用两种方法：一种是unicap荧光酶联免疫法；另一种是HOB膜条法, HOB膜条法采用酶联免疫法(ELISA)快速试纸条技术检测血清中的过敏原特异性IgE抗体。测试条的检测区域由多个反应区组成, 其中包括一个阴性对照区和一个阳性对照区。患者血液样本先与包被有多种过敏原的测试条进行孵育, 使得样本中的特异性IgE抗体与测试条上的相应过敏原结合。随后去除未结合的抗体, 加入酶标抗体, 孵育。随后的清洗步骤会去掉未结合的酶标抗体, 加入酶底物液进行反应, 产生可以直接观察的颜色变化, 得出定性结果。亦可以通过专用过敏原扫描分析软件, 得到半定量结果。本次实验用膜条自动操作仪及手工用试剂盒对同一样本进行检测10种过敏原,分别为屋尘螨(D1)﹑猫毛(E1)﹑狗皮(E5)﹑花生(F13)﹑大豆(F14)﹑鸡蛋(F1)﹑牛奶(F2)﹑豚草(W1)﹑艾蒿(W6)和交链孢霉,分别记录检测结果。以上所有检测实行全过程质量控制

1.3 结果判定 根据sIgE浓度(IU/ml)将结果分为0～VI级,其中“0”级为阴性, I～VI级为阳性。

1.4 统计学方法 数据分析采用SPSS18.0软件分析, HOB膜条仪器测定结果与CAP法测定结果按照吻合度作分析, HOB膜条法仪器与手工法对比数据分析采用Kappa检验。

2 结果

2.1 两种检测方法各项结果见表1。以unicap法作为参照,评价膜条法和unicap法测定结果的吻合度。两种方法共检测237项, 检测结果完全一致的为 203项, 即符合率为 85.6%。检测结果不一致的为 34 项, 比例为 14.4%。牛奶(F2)的吻合度不理想, 只有68.09%。

2.2 HOB膜条仪器测定和手工测定结果对比见表2, 仪器测定整个程序由仪器完成, 操作简捷, 但由于仪器进样口和出样口都为单通道, 所以当仪器进行多样品检测时耗时比较长。手工法测定分别经历加样﹑孵育﹑加试剂﹑多次洗涤﹑显色等过程才能完成, 显得比较繁琐, 但实验耗时相对较短。结果显示, 大多数sIgE, 仪器与手工测定定性结果具有较高的一致性(Kappa系数＞0.6), 阳性符合率﹑阴性符合率﹑总符合率均＞95%。

表1 unicap法与HOB膜条仪器测定结果对比

表2 HOB膜条仪器测定和手工测定结果对比(标本数：80)

3 讨论

变态反应病的诊断流程主要有三个方面：详尽的临床资料﹑体内试验和体外检测结果［3］。变应原体内检测技术通过皮内注射﹑针刺﹑划痕等方法将多种变应原注入体内, 诱发I型超敏反应, 从而判断是否对某种变应原致敏, 但对于过敏体质患者可能会造成不同程度生理或病理反应, 为慎重起见,目前已少有。与此相比, 体外sIgE检测, 能同时检测多种过敏原, 不受临床用药情况影响, 安全等优点, 得到临床广泛应用。在众多sIgE检测系统中, 基于荧光酶联免疫原理的CAP系统最有代表性, 是国内外广泛应用的变应原检测系统［4］。该法对sIgE的检测准确可靠, 结果与临床相关性好, 但存在着价格昂贵, 检测通量小等缺点。随着过敏性疾病日益增多以及人们对该病的认识, 一种经济﹑高效﹑快速的初筛检测方法更能满足临床需求［5］。HOB膜条采用了高效级联抗体放大(high efficiency cascade of antibody amplification, HECA)技术, 与传统的ELISA法相比, HECA技术包被的高质抗原,使抗原决定簇充分暴露, 充分与抗体结合, 提高检测的灵敏度, 其高纯度的封闭剂, 避免样本中非特异性IgE的结合, 提高检测的特异度, 结合液采用定制的单克隆二抗, 高效特异的结合抗原抗体复合物, 有效地放大了IgE信号, 提高检测灵敏度, 结果准确可靠。将多种抗原包被在一张纤维膜条上,通过一次反应即可检测多种sIgE。反应后的膜条具有良好稳定性, 原始结果可以长期保存。本次实验表明：与传统“金标准”CAP法相比较, 检测结果具较好符合性, 一些本地区常见的过敏原屋尘螨﹑猫毛﹑狗皮结果吻合度都比较好, 但牛奶的结果吻合度只有68.09%, 原因可能是抗原表位及其来源区域不一致导致结果差异［6］, 故本研究认为对F2(牛奶) sIgE检测HOB膜条法检测结果与CAP方法相比较, 结果吻合度不理想。从本次实验结果来看, 吸入性过敏原的吻合度高于食物性过敏原的吻合度。作为一种半定量/定性的初筛产品, 其检测结果还是比较令人满意的。同时, 针对HOB膜条全自动操作仪的特点(该操作仪拥有高达48条/次高通量,但由于仪器进样口和出样口都为单通道, 所以当仪器进行多样品检测时耗时比较长), 故本研究也对HOB膜条仪器测定和手工测定结果进行对比, 结果显示, 除F13和F2外, 其他种类过敏原, 仪器与手工测定的定性结果一致性都比较理想(Kappa均＞0.6), 阳性符合率, 阴性符合率, 总符合率也比较理想。F13(花生)一致性差主要是由于其阳性符合率低所造成的, 原因可能由于阳性标本过少所造成的。F2(牛奶)阳性符合率, 阴性符合率都低, 结合该法与CAP结果的吻合度分析, 考虑HOB膜条法对于F2(牛奶)过敏原检测结果可靠性有待提高。综上所述, 对于一些标本量比较少或者希望能在较短时间内得出检验结果的实验机构来说, HOB膜条法手工测定对于检测吸入性过敏原是一种可信赖的定性检测方法。

本组实验表明, HOB膜条法具有阴阳定性符合率与“金标准”unicap法较好的相关性, 该膜条自动操作仪, 利用单片机控制电机及接合机械配件替代人手操作, 使用者可根据不同试剂反应条的要求编排其操作流程, 整个程序由仪器完成,操作简捷, 检测成本低, 是一种值得推广的定性检测方法。

［1］ Fontaine C, Mayorga C, Bousquet PJ, et al.Relevance of the determination of serum -specific IgE antibodies in the diagnosis of immediate beta-lactam allergy.Allergy, 2007,62(1):47-52.

［2］ 宋志强, 郝飞.变应原检测的再认识.临床皮肤科杂志, 2006, 35(5):333.

［3］ 叶世泰.变态反应学.北京:科学出版社, 1998:118-127.

［4］ 张升, 朱威.常用过敏原检测方法的探讨.中华临床医师杂志(电子版), 2011,5(19):5753-5755.

［5］ 王瑞琦, 尹佳.ImmunoCAP250 TM检测过敏原特异性IgE抗体的方法评价.中华临床免疫和变态反应杂志, 2007,1(1):67.

［6］ 王美玲, 冯珍加, 李志艳, 等.斑点免疫印迹法检测特异性IgE抗体的比对分析.中国实验诊断学, 2011,15(3):430-432.

510220 广州市红十字会医院(彭洁雅)；广州医科大学附属第一医院(孙宝清 郑佩燕)

孙宝清