FQ-PCR法痰结核杆菌DNA检测及其临床应用

宋予娟

FQ-PCR法痰结核杆菌DNA检测及其临床应用

宋予娟

目的 探讨荧光定量聚合酶链式反应 (FQ-PCR)法痰结核杆菌DNA检测及其临床应用。方法 分别以FQ-PCR, 集菌培养和染色镜检检测入选患者的痰标本, 比较各方法在结核病诊断中的作用。结果 三种检测方法的敏感性为71.8%, 39.0%, 26.5%, 显示FQ-PCR法敏感度最高。结论FQ-PCR法具有简便、快捷、敏感、特异性高的特点, 可以快速及时准确的为临床提供诊断依据。

痰;结核杆菌;荧光定量聚合酶链反应

结核病是严重危害人类健康的传染病, 曾一度得到控制,但目前其仍是全球性的重大公共卫生问题之一。结核分枝杆菌的实验室检测是结核病诊断和治疗转归的重要依据。传统结核杆菌检测痰涂片抗酸染色镜检阳性率低, 集菌培养周期太长而荧光定量FQ-PCR是近年发展起来的一种重要的基因诊断技术［1］, 显示出了其灵敏度高, 特异性强, 快速简便等特点, 得到了广泛的应用［2］。本研究采用Taqman荧光定量聚合酶链反应技术检测痰标本结核杆菌DNA, 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 2010年4月~2012年1月到本院诊断与治疗患者的痰液标本112份, 其中男74份, 女38份, 年龄17~65岁。病例入选根据临床症状体征及胸部X线表现临床诊断为结核病患者64例(肺结核组), 非结核病患者48例(非结核组)。

1. 2 痰标本收集 使用带盖无菌样本盒, 交由患者自行留取痰标本。要求患者晨起后漱口, 深咳出1~2口痰入样本盒,加盖送检。

1. 3 试剂和仪器 4%NaOH, FQ-PCR试剂盒由深圳凯杰生物工程有限公司提供, 仪器由上海宏石生产的荧光定量分析仪分析。

1. 4 抗酸染色法与集菌培养法 操作参考《结核病诊断细菌学检验规程》［3］进行。

1. 5 痰液DNA的提取 按试剂盒说明书取0.9 ml痰标本加入2倍样本体积40%NaOH液化后13000 r/min离心10 min去上清液向沉淀中加入1 ml灭菌水, 充分震荡混匀, 13000 r/min离心10 min去上清液重复洗涤3次。沉淀中加入30 μl DNA提取液充分震荡混匀100℃水域10 min待冷却至室温13000 r/min离心10 min去上清液备用。

1. 6 FQ-RCR法 按试剂操作说明书对上述DNA模版加入PCR反应管, 按规定循环参数进行PCR反应。利用阳性梯度标准品的CT值(循环阈值)所制作的标准曲线制定出样品的DNA拷贝数。

2 结果

64例结核病例, 48例非结核病患者痰标本染色镜检, 集菌培养, FQ-PCR, 其阳性率分别为26.5%, 39.0%, 71.8%。而48例非结核组FQ-PCR检测为0, 符合率100.0%。结果见表1。

表1 64例结核, 48例非结核病患者痰标本染色镜检, 集菌培养, FQ-PCR检测结果(n, %)

3 讨论

结核杆菌有人型、牛型、鸟型、鼠型和冷血动物型等,对人类主要是人型, 结核杆菌主要感染途径为呼吸道, 也可以通过破损黏膜和消化道等多种途径进入人体, 侵犯各部位组织, 引起相应的结核病, 以肺结核多见, 此结核为乙类传染病, 危害大, 肺结核早诊断并进行正规治疗对预后治疗有明显的影响。病原学检查确认结核杆菌感染是肺结核诊断的“金标准”。

由此可见, 直接涂片法虽具有简便、快捷、价廉等特点,但无法辨别出死菌和活菌且受实验室条件、人员环境、技术水品的影响较大, 灵敏度低, 特异性差, 各种抗酸杆菌均可着色, 有些耐药菌对抗酸染色不敏感, 难以查到出现假阳性结果。集菌培养法, 时间长且灵敏度低, 特异性差, 检验结果滞后［1］。而FQ-PCR法简便快捷灵敏度高, 重复性好并且极大地缩短了检测时间, 适合应用于结核病的临床快速诊断。FQ-PCR方法检测的是病原体核酸, 不管结核杆菌是否为活的细菌, FQ-PCR均能检出, 因此, 在经抗生素治疗1个疗程后, 必须两周后才能做FQ-PCR检测, 以避免临床假阳性。但目前试剂性能和结果检测的方法各异, 在结核杆菌感染的诊断上, 抗酸染色和FQ-PCR同时阳性即可确诊。如FQ-PCR阳性, 抗酸染色阴性, 应重复检测标本, 直到FQPCR或抗酸染色阳性才可确诊；如抗酸染色阳性, FQ-PCR法阴性, 应重复检测, 并排除非结核分歧杆菌感染的可能。并且FQ-PCR法检测结核分枝杆菌变化情况, 观察抗结核药物的治疗进展为临床医生及时掌握患者的病情和开展后续督导治疗提供了动态数据, 在实践中起到了积极作用, 效果明显, 有重要的临床意义。

［1］ 邬艳. 荧光定量PCR检测痰结核杆菌特异性DNA序列及其临床应用. 中外医学研究, 2012, 10(16):65-67.

［2］ 谢汉彬, 郑崇辉, 黄国盛 . 实时荧光定量PCR法在检测血浆结核杆菌DNA的应用. 河北医学, 2012, 18(5):698-699.

［3］ 金建东. 荧光定量PCR检测痰结核杆菌DNA及其临床应用.齐齐哈尔医学院学报, 2010, 31(22):3565.

Detection of sputum mycobacterium tuberculosis DNA by PCR method and its clinical application

SONG Yu-juan.
Department of Inspection, Henan Xinxiang City the First People’s Hospital, Xinxiang 453000, China

Objective To investigate the detection of sputum mycobacterium tuberculosis DNA by polymerase chain reaction (PCR) method and its clinical application. Methods Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), culture and dyeing mirror inspection were applied to detect sputum specimens of chosen patients. The effects of the methods were compared in diagnosis of tuberculosis. Results The sensitivity of the three methods of detection were retrospectively 71.8%, 39%, and 26.5%, which showed that FQ-PCR had the highest sensitivity. Conclusion FQ-PCR method is simple, quick, and sensitive. It can quickly and timely provide clinical reference for diagnosis.

Sputum; Mycobacterium tuberculosis; Fluorescence quantitative polymerase chain reaction

2014-08-27］

453000 河南省新乡市第一人民医院检验科