甲胎蛋白抑制PTEN活性导致肝癌细胞耐受ATRA诱导的凋亡的研究

张蕾 邢绍芝 张婷婷 赵磊磊

甲胎蛋白抑制PTEN活性导致肝癌细胞耐受ATRA诱导的凋亡的研究

张蕾 邢绍芝 张婷婷 赵磊磊

目的 研究分析甲胎蛋白对PTEN活性产生抑制引起肝癌细胞耐受ATRA发生凋亡。方法 选取2012年11月~2013年11月期间本院诊治36例肝癌患者, 将患者术后肝癌细胞制成标本。结果 人体肝癌HepG2与Bel 7402细胞均存在PTEN表达, 经160 μmol/L的ATRA处理24 h后可加强这些细胞的PTEN的表达。Co-IP技术实验得知甲胎蛋白可与PTEN相结合, 最终对ATRA产生影响。结论 肝癌细胞中表达的甲胎蛋白可与PTEN相结合, 最终发现AFP为肝癌细胞耐受ATRA的重要因子。

甲胎蛋白；PTEN活性；肝癌细胞；ATRA

肝癌是人类健康最大的威胁疾病中的一种, 因为受到病毒性肝炎、环境等有关因素的影响, 导致肝癌发病的机率逐渐升高。因为肝癌细胞会出现再生、转移, 同时癌细胞对药物存在一定的耐受, 从而增加了治疗难度。因此, 充分掌握肝癌耐药因子的机制, 对临床肝癌的治疗十分重要。甲胎蛋白(简称AFP)是肝癌细胞合成的具有很高特异性的蛋白质之一, 绝大多数肝癌患者在发病期会产生AFP基因高表达的特点, 并且AFP是肝癌诊断的金标准。有资料指出, 肝癌细胞产生的AFP能加强肿瘤细胞增殖与诱导肿瘤细胞的双重作用。PTEN则是将3-磷酸肌醇(简称PIP3)水解成2-磷酸肌醇(简称PIP2)的磷酸酶, 同时可以避免3-磷酸肌醇激酶(简称PI3K)磷酸化蛋白激酶B(简称PKB/AKT), 导致PI3K/ AKT信号传导被中断, 可见是一种非常关键的抑癌基因。AFP的生物学性质可能还存在对ATRA抗凋亡产生诱导作用,但是肝癌细胞合成的AFP在机体中肝癌细胞耐受凋亡过程具体发挥的作用报道较少, 现本次研究进一步探讨AFP在人体肝癌细胞中对PTEN活性产生的影响, 总结如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2012年11月~2013年11月期间本院诊治36例肝癌患者, 并在患者术后肝癌组织中提取HLE、HepG2、Bel 7402细胞加以培养。实验蛋白质材料：ser 473多克隆抗体、兔抗人AKT/PKB多克隆抗体、小鼠抗人AFP单克隆抗体均源自PS公司。Β-Actin单克隆抗体及鲁米诺试剂源自SC公司。兔抗人PTEN多克隆抗体由美国实验室视觉公司生产。二抗是羊抗兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶连接的羊抗鼠。FITC标记的羊抗兔与TRITC标记的羊抗小鼠二抗由美国杰克逊IR公司生产。RNA干扰试剂盒, 即癌/ GFP / Neo si-RNA表达载体试剂盒由上海吉玛公司提供。Ly294002及ATRA由Sigma提供。pcDNA3.1载体源自广州泰盛公司。

1. 2 方法 应用Western blotting法对全反式维甲酸(简称ATRA)进行分析并处理人体肝癌HepG2、Bel 7402细胞24 h后, PTEN表达产生变化的情况［2］。通过免疫共沉淀(简称Co-IP)技术分析PTEN与AFP之间相互作用。应用激光共聚焦显微镜监测PTEN与AFP在细胞内的共定位情况。通过RNA干扰(即指RNAi)技术对AFP的表达产生抑制作用, 然后采用ATRA处理24 h后, 检测细胞中PTEN表达发生变化的情况, 同时研究蛋白激酶B(简称AKT)的磷酸化程度。再利用pcDNA3.1质粒、人体afp基因连接组成表达AFP的载体(简称pcDNA3.1-afp), 最后转染成不表达AFP的人体肝癌HLE细胞。

1. 3 统计学方法 运用统计学软件SPSS16.0对组间试验研究数据加以统计学分析, 应用t法对组间计量资料进行检验, 应用χ2检验对组间计数资料进行检验。如若对比差异P＜0.05, 则充分表明组间差异有统计学意义。

2 结果

人体肝癌HepG2、Bel 7402细胞均存在PTEN的表达,通过160 μmol/L浓度的ATRT处理24 h后可加强这些肝癌细胞内PTEN的表达。经Co-IP技术实验可知AFP可与PTEN相结合。采用共聚焦纤维镜监测发现PTEN与AFP之间共定位在细胞浆。在干扰AFP表达以后, 发现PTEN表达显著升高,表达前后具有统计学差异。而抑制AFP表达以后,ATRA可明显增强Bel 7402细胞中PTEN的表达, 同时可以使AKT磷酸化受到抑制。当转染pcDNA3.1-afp载体以后, 肝癌HLE细胞中存在AFP表达, 同时能和PTEN相结合, 由此可知pcDNA3.1-afp载体可以促进AKT磷酸化(即为p-AKT), 从而对抗ATRA使HLE细胞增殖受到抑制。详见表1、图1~3。

图1 HepG2、Bel 7402细胞在PTEN的表达

图2 Bel 7402细胞的具体表达

3 讨论

肝癌细胞中出现AFP高表达的现象, 可能与癌细胞在体内过度的生殖、转移以及侵袭存在很大关系。有资料指出使AFP表达被抑制, 可以诱导肝癌细胞逐渐凋亡。AFP同细胞中的部分信息物质相互结合, 进而对凋亡信息的传导产生影响。其中, AKT、PTEN以及AFP表达的检测, 能分析出AFP与AKT磷酸化、PTEN功能之间的关系［3,4］。本次研究得出人体肝癌HepG2、Bel 7402细胞、HLE内均存在PTEN表达。但HepG2、Bel 7402细胞高表达AFP, HLE细胞则不表达AFP。AKT为肝癌细胞传递、生长信号的重要因子, 在癌细胞生长期间起到中心信息物质的作用, 所以AKT活化程度说明癌细胞生长旺盛。本次研究得出, 人体内肝癌Bel 7402细胞由于受到ATRA作用, 以至于PTEN表达明显提高, 由此得知PTEN基因可以在肝癌细胞内有效被激活。通过免疫共沉淀技术发现肝癌细胞产生的AFP能够与PTEN相互结合, 组合成复合体。进一步表明PTEN与AFP之间具有相互作用的可能。利用共聚焦纤维镜监测Bel 7402细胞内的PTEN、AFP可见, 其多分布在细胞浆内, 仅有一小部分PTEN蛋白分布在细胞核中, 由此表明PTEN蛋白与AFP在细胞浆内能够出现共定位现象。

AFP可通过下面两种途径对PTEN磷酸化作用造成抑制［5,6］：①AFP可抑制PTEN表达, 以利于降低PTEN水解生成PIP3。②AFP能够与PTEN相互结合, 利用两者之间的互相作用, 对PTEN磷酸酶活性产生抑制, 使AFP能够最快速度的使PI3K/AKT信号被激活。可见AFP对PI3K/AKT信号激活的过程, 考虑是AFP强化癌细胞生殖、转移以及侵袭的主要机制［7］。AFP的生物学性质能够对信息分子样产生调节作用。因为PTEN正常表达情况下, 可以增强癌细胞对药物的敏感性, 可见靶向干扰AFP表达能有效诱导肝癌细胞凋亡, 并且抑制AFP强化癌细胞生长的新的有效策略。

表1 干扰AFP表达后基因变化情况

图3 HepG2 细胞的具体表达

［1］ 朱明月,符史干,李孟森,等.甲胎蛋白抑制 PTEN 活性导致肝癌细胞耐受 ATRA 诱导的凋亡.生物化学与生物物理进展, 2011, 38(3):227-238.

［2］ 米登海.PTEN与VEGF在原发性肝细胞癌中的表达及相互作用.华中科技大学, 2010,12(20):132-133.

［3］ 王丽.抑癌基因PTEN在肝癌组织中的表达及HCV核心蛋白对PTEN作用的研究.第四军医大学, 2010,12(10):455-456.

［4］ 姚悦萍,王娟华,陆忠华,等.血清甲胎蛋白异质体对肝细胞癌的诊断意义.实用肝脏病杂志, 2011,23(4):541-542.

［5］ 陈伟.抑癌基因PTEN、p27在肝细胞性肝癌组织中的表达及临床相关性研究.安徽医科大学, 2010,23(13):557-559.

［6］ 沈慧.原发性肝癌中PTEN蛋白表达及其与HBV感染的关系.山西医科大学, 2010,22(11):821-825.

［7］ 秦敏. PTEN、p-Akt在白藜芦醇抑制人肝癌细胞增殖与促进其凋亡中的作用.河北医科大学, 2010,14(10):451-453.

Inhibited the activity of PTEN by alpha fetal protein caused resistance to all trans retinoic acid of hepatoma cells

ZHANG Lei, XING Shao-zhi, ZHANG Ting-ting,
et al. Department of Epidemiology, Binzhou Medical University, Binzhou 256600, China

Objective To study and analyze inhibition of PTEN activity by alpha fetal protein caus ed resistance to all trans retinoic acid of hepatoma cells. Methods Select in November 2012 to November 2013 in the hospital make a diagnosis and give treatment of 36 cases of liver cancer patients, the patients of postoperative liver cancer cell specimen. Results Human hepatocellular carcinoma HepG2 and Bel 7402 cell expression PTEN, 24, 160 mu of mol/L ATRA treatment can strengthen the cells the expression of PTEN as a child. Co-IP technology experiment told that AFP can be combined with PTEN, ultimately affect ATRA. Conclusion The liver cancer cells express AFP can be combined with PTEN, eventually found the AFP for the most important factors of liver cancer cells resistant to ATRA.

Alpha fetal protein; PTEN activity; Liver cancer cells; ATRA

256600 滨州医学院传染病学教研室(张蕾)；滨州医学院附属医院肿瘤科(邢绍芝), 检验科(张婷婷 赵磊磊)