BDNF基因多态性与散发性阿尔茨海默病患者认知功能的相关性研究

李家鑫 祭健予 李 剑 欧俐羽 韦斌垣

·论著·

BDNF基因多态性与散发性阿尔茨海默病患者认知功能的相关性研究

李家鑫 祭健予 李 剑 欧俐羽 韦斌垣

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)基因功能性多态(rs6265)与散发性阿尔茨海默病(SAD)发病的相关性。方法 选取58例散发性阿尔茨海默患者(SAD组)与52例健康老年人(对照组),用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术, 对BDNF基因rs6265, 进行基因型检测, 同时利用酶联免疫吸附技术对两组患者的血清BDNF水平进行检测。结果 在<60岁的人群中, 等位基因(χ2=6.0595, P=0.013)及基因型(χ2=6.0826, P=0.0478)在两组人群中的分布差异有统计学意义, 并且SAD的AA基因型患者的血清BDNF水平最低［(14.32±4.21)ng/ml, F=7.2545, P=0.0016］。结论 BDNF基因功能性多态rs6265与SAD发病相关, 并且影响其血清BDNF的表达。

脑源性神经营养因子；阿尔茨海默病；功能性多态性

阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病, 临床主要表现为进行性记忆障碍、认知障碍和精神异常。脑源性神经生长因子(BDNF)能够支持前脑、海马及皮质胆碱能神经元的生存、分化和修复, 并且在突触可塑性中发挥了重要的作用, 因此与学习和记忆有着密切的联系。据报道, BDNF参与了AD的发病［1］, 因此本文将从BDNF基因的功能性多态(rs6265)层面来探讨BDNF与散发性阿尔茨海默病(SAD)患者认知功能的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2010年1月~2011年3月在广西医科大学第一附属医院神经内科和江滨医院神经内科住院的SAD患者58例, 其中男性40例, 女性18例, 年龄57~76岁, 平均(66.66±11.82)岁, 病程1~16年, 平均发病年龄(63.03±7.24)岁, 平均病程(6.62±4.565) 年。所有患者均进行了临床检查、简易智能状态检查(mini-mental state examination, MMSE)、Hachinski缺血评分和画钟测验(clock drawing test, CDT), 并经过至少2名神经科专家诊断, 所有AD患者均符合NINCDS-ADRDA“很可能AD”诊断标准［2］。所有SAD患者均除外患严重躯体疾病、有抑郁症状和痴呆家族史者。对照组为同期52例在本院行体检的健康老年人, 其中男性33例, 女性19例, 年龄56~74岁, 平均(63.75±9.14)岁。SAD组和对照组患者在年龄(U=0.9532, P=0.3398)、性别构成(χ2=0.3721, P=0.5412)及受教育程度(年)上［(12.65±5.72) VS (13.14±4.77), t=0.4848, P=0.6288］上均差异无统计学意义。所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要材料 MJ PTC-220 PCR仪; 紫外光凝胶电泳成像分析系统; 血液基因提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司), 2×TaqPCRMasterMix (北京康为世纪生物科技有限公司), 琼脂糖(北京天根生化科技有限公司), gene finder核酸染料(Takara公司), 5×TBE ［生工生物工程(上海)有限公司］, DNA marker(600bp)(广州东盛生物科技有限公司), Eco72I快速酶(Thermo公司)；人脑源性神经营养因子(BDNF)快速检测试剂盒(CUSABIO, CSB-E04501h), Bio-RAD imark酶标仪。

1.3 血样采集 所有患者均空腹采取静脉血5 ml, 将其中的2 ml沿管壁缓慢注入含肝素抗凝管中, 立即于-70℃冷冻存放以行基因检测；余下的缓慢注入非抗凝管中, 室温放置60 min后以1000 r/min离心20 min, 取血清分装于EP管中,置-70℃低温冰箱保存, 以检测BDNF。

1.4 基因检测 使用血液DNA提取试剂盒(离心柱型)提取血液DNA。BDNF基因G196A上游引物:5‘-AAGAAGCAAACATCCGAGGACA-3’, 下游引物:5‘-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3’, 引物由深圳华大基因科技有限公司合成。然后应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCRRFLP)技术扩增目的DNA片段并进行基因分型。PCR扩增循环条件：94℃起始5 rain, 94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循环反应35次, 72℃延伸5 min。PCR扩增产物经Eco72I快速酶切, 酶切产物即刻进行2.0%琼脂糖凝胶电泳, 在紫外光凝胶电泳成像分析系统上进行扫描、拍照,并进行图像分析, 对BDNF G196A进行基因分型。

1.5 BDNF的检测采用人BDNF ELISA试剂盒测定, 按说明书操作, 最后用酶标仪读数, 取单波长450 nm, 用空白孔调零, 然后测定各孔光密度(OD值)。用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式, 将样品的OD值代入方程式, 计算出样品浓度, 再乘以稀释倍数2, 即为样品的实际浓度。

1.6 统计学方法 用SPSS17.0统计软件, 在检验水准α=0.05的基础上, 两样本均数的比较以均数±标准差s)表示, 采用t检验, 两样本构成比的比较采用χ2检验；基因型频率和基因频率采用基因计数法, 吻合度检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡。P<α表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BDNF多态性位点分析 BDNF G196A位点PCR产物的酶切电泳结果：PCR产物长度为500 bp, 当等位基因为G时, PCR产物经Eco72I酶切后形成131 bp和369 bp片段, 在凝胶电泳图上显示2条电泳带；当等位基因为A时PCR产物不能被Eco72I酶切, 片断长度为500 bp, 在凝胶电泳图上显示1条电泳带；当等位基因为杂合型A/G时, 在凝胶电泳图上显示3条电泳带, 见图1。

图1 BDNF G196A酶切图谱

2.2 BDNFVal66Met多态性检测

2.2.1 Hardy-Weinberg 吻合度检验 SAD组与对照组3种基因型观察值与期望值检测符合Hardy-Weinberg平衡定律(SAD组χ2=0.064, P=0.800；对照组χ2=0.076, P=0.783), 表明其基因型频率分布已达到遗传平衡, 具有群体代表性。

2.2.2 BDNF G196/A多态性与SAD的相关性分析 见表1, SAD组和对照组中AA、AG及GG 3种基因型频率 (χ2=0.0129, P=0.994)和A、G等位基因频率的差异无统计学意义(χ2=0.0128, P=0.910)。

2.3 血清BDNF的表达 SAD组患者的血清BDNF水平(17.21±3.15)ng/ml明显比对照组(21.85±5.42)ng/ml的低(U=5.4085, P＜0.001)；在SAD组中, AA基因型的患者, 其血清BDNF水平(14.32±4.21)ng/ml均比AG基因型患者(17.05±3.53)ng/ ml和GG基因型患者(19.42±3.36)ng/ml的要低(F=7.2545, P=0.0016), 提示了基因的表达影响了BDNF的表达。

2.4 SAD患者认知功能评估 如表2所示, 3种基因型的患者认知功能评估中, 定向力、语言能力、视空间觉以及画钟试验差异无统计学意义, 而瞬时记忆力、注意力计算力及短时记忆差异有统计学意义, 其中以A/A基因型患者的最低。

表1 BDNF基因的功能性多态(rs6265)等位基因及基因型在SAD和正常者中的分布比较

表2 不同基因型患者的认知功能的比较(s)

表2 不同基因型患者的认知功能的比较(s)

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3 讨论

认知功能包括定向、注意、记忆、计算、分析、综合、理解、判断、结构能力、执行能力等, 如果多个认知域发生障碍,则为认知功能障碍［3］。SAD的认知功能损害在疾病的不同阶段表现不同, 早期主要为记忆障碍, 以延迟记忆障碍明显,同时伴有注意、计算及执行功能等障碍。在中晚期, 可出现远期记忆障碍, 分析、理解和判断能力障碍, 甚至出现人格改变和精神症状等。而BDNF作为神经营养因子中的一个重要成员, 除具有调节神经元发生、发展及维持的基本作用外,还可通过调节突触可塑性影响学习和记忆等功能［4］。

单核苷酸多态性是人类基因组中最常见的一种遗传多态, rs6265是位于BDNF基因的编码外显子, 是目前已知的BDNF基因的功能性多态, 其G/A多态导致第66位氨基酸密码子的改变, 使编码氨基酸发生Val-Met(撷氨酸-蛋氨酸)的转换, 并影响BDNF的分泌［5］。有报道, BDNF基因多态性与绝经后妇女的认知功能障碍有关［6］。作者在本次研究中发现, SAD组和对照组中AA、AG及GG3种基因型频率和A、G等位基因频率虽差异无统计学意义, 但SAD组患者的血清BDNF水平显著低于比对照组患者。同时, 将SAD组患者按基因型进行分组分析也发现, AA基因型患者的瞬时记忆力、注意力计算力及短时记忆得分显著低于AG和GG基因型患者的, 而在定向力、语言能力、视空间觉和画钟试验上差异有统计学意义。以上研究结果说明了AA基因型的患者在记忆力方面的障碍重于其它的认知功能, 与李娜等［7］的报道相似, 他们认为, BDNFMet等位基因可能参与了患者的抽象思维能力以及记忆过程。这可能与受Met转染的海马神经元存在活性依赖的BDNF分泌减少［8］, 可能导致了海马胆碱能系统逆行性运输减少, 造成与SAD相关的基底前脑胆碱能神经元进行性凋亡及海马神经元变性从而导致了SAD认知功能障碍。

综上所述, BDNF基因的功能性多态-rs6265影响了BDNF的表达, 从而引起了SAD的认知功能。因此, 如何利用外源性BDNF来预防和改善SAD的认知功能, 将是以后研究的热点。

［1］ Mattson MP, Maudsley S, Martin B.BDNF and 5-HT:a dynamic duo in age-related neuronal plasticity and neurode-generative disorders.Trends Neurosci, 2004, 27(10):589-594.

［2］ McKhann G, Draehman D, Folstein M, et al.Clinical diagnosis of Alzheimer’s disease Report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer’s disease.Neurology , 1984, 34(7):939.

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［5］ Egan MF, Kojinma M, Callicott JH, et al.The BDNF val66met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function.Cell, 2003, 112(2):257-269.

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［7］ 李娜, 高成阁, 陈策, 等.BDNF基因多态性与抑郁症及认知功能的关联研究.西安交通大学学报(医学版), 2012, 33(6):754-759.

［8］ Egan MF, KojimaM, Callicott JH, et al.The BDNF Va166Met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function.Cell, 2003, 112(2):257-269.

Correlation study between functional polymorphism of BDNF rs6265 and sporadic Alzheimer's disease

LI Jia-xin, ZHAI Jian-yu, LI Jian, et al. Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

Objective To explore the relationship between functional polymorphism of BDNF(brainderived neurotrophic factor) rs6265 and sporadic Alzheimer’s disease(SAD).Methods Selecting 58 cases of SAD(SAD group) and 52 health old person(control group) as research subjects.Then the genotyped was detected via polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism and serum levels of BDNF detected by Enzyme-linked Immunosorbent Assay in all cases.Results There was significantly difference in the distributions of alleles(χ2=6.0595, P=0.013) and genotypes(χ2=6.0826, P=0.0478) between the case of SAD group and control group ,and the serum levels of BDNF were lowest for case of AA genotypes in SAD[(14.32±4.21) ng/ml, F=7.2545, P=0.0016].Conclusion The functional polymorphism of BDNF gene(rs6265) correlated with pathogenesis of SAD and affects the expression of BDNF in serum.

Brain-derived neurotrophic factor; Alzheimer’s disease; Functional polymorphism

2014-03-18］

广西科学青年基金资助项目(项目编号：桂科青0991036)

530021 广西医科大学第一附属医院神经内科

韦斌垣