虫茶香气成分分析和体外功能性效果

2014-09-02王睿赵欣

江苏农业科学 2014年7期

关键词：香气成分抑制率功效

王睿　赵欣

摘要：通过气质联用（GC-MS）分析、清除DPPH自由基试验、抗突变试验、AGS及HT-29癌细胞增殖抑制试验，明确虫茶的香气成分及其体外功效。结果发现，虫茶香气成分主要包括11种，这些成分具有体外抗氧化、抗突变、抗癌效果。

关键词：虫茶；香气成分；功效；抑制率

中图分类号： TS275.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0327-03

收稿日期：2013-10-14

作者简介：王睿（1982—），男，重庆人，硕士，讲师，研究方向为功能性食品的保健效果。Tel：（023）65628256；E-mail：foods@live.cn。

通信作者：赵欣，博士，教授，研究方向为功能性食品的保健效果。Tel：（023）64099815；E-mail：zhaoxin@zhaoxin.org。虫茶是一种特殊的保健茶，它不属于普通茶的范畴，是以昆虫食用叶片后经过其体内作用生产出来的特殊茶饮料[1]。目前，用来生产虫茶的昆虫有夜蛾科弓须亥夜蛾、雪疽夜蛾、螟蛾科米缟螟、白条谷螟，这些昆虫的幼虫取食苦藤茶、虫茶、化香树、大百解、三叶海棠等植物叶片后，排出颗粒，将其收集后经过一系列加工的产品即为虫茶产品[1]。虫茶作为传统饮品和中药，具有清热、去暑、解毒、健胃、助消化等功效，对腹泻、鼻衄、牙龈出血、痔出血均有较好疗效，是一种很好的医药保健饮料[2]。传统饮茶方式是用热水冲泡茶叶，大量挥发性成分在冲泡过程中散失，泡茶过程中的香气就是这些挥发性物质产生的。近年来，关于茶叶香气成分的研究已经陆续开展[3]，虫茶香气成分及其作用有待于研究。本研究通过气质联用（GC-MS）法对贵州省产虫茶的香气成分进行了分析，并对这些香气成分物质进行了体外的抗氧化、抗突变、抗癌试验，以期为推广虫茶提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

供试虫茶为市售、原产于贵州省的虫茶。

试剂：无水乙醚（色谱纯）、癸酸乙酯（色谱纯）、无水硫酸钠（分析纯），上海士瑞化工实业有限公司生产；NaH2PO4·2H2O、FeCl3、三氯乙酸，广州化学试剂厂生产；2-硫代巴比妥酸，国药集团化学试剂有限公司生产；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、维生素C、D- biotin、L- histidineoHCl（monohydrate）、D- glucose- 6- phosphate、NADP，美国Sigma公司生产；DMSO，日本纯正化学株式会社生产；RPMI 1640 培养液、FBS、trypsin、EDTA、100 U/mL Penicillin- Streptomycin，美国Gibco公司生产。

致突变物：N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG），美国Aldrich公司生产。标准菌株：TA100营养缺陷型鼠伤寒沙氏菌，美国Sigma公司生产。癌细胞：AGS 胃癌细胞株、HT-29 结肠癌细胞株，韩国细胞株银行生产。

1.2主要仪器和设备

LS-B75L型高压蒸气灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；WPL-30型恒温培养箱，江东精密仪器有限公司；同时蒸馏萃取（SDE）装置，安徽省天长市华玻实验仪器厂；UV-1750型紫外分光光度计，日本岛津公司；Agilent 7890/5975 GC-MS（配置电子轰击源），美国安捷伦公司；VS-15CFN型冷冻离心机，韩国Vision科学株式会社；MC096型二氧化碳培养箱，日本三洋电机株式会社；Elx800型酶标仪，美国Bio Tekinstruments公司。

1.3试验方法

1.3.1虫茶香气物质的提取通过SDE法对虫茶香气物质进行提取。将虫茶样品打碎，称取50 g于SDE装置的2 L圆底烧瓶中，加入煮沸的蒸馏水1 L，同时加入10 g/mL癸酸乙酯0.5 mL以及少许玻璃珠，用50 mL重蒸乙醚萃取。对电热套加热，微沸下提取20 min。向乙醚萃取液中加入无水硫酸钠除去水分。4 ℃静置1 d后用N2浓缩提取液至0.2 mL，重复该过程5次，将5次收集到的提取液合并，冷冻干燥后加入DMSO备用[4]。

1.3.2GC-MS法测定虫茶成分和含量GC分析条件：HP-5 MS柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度 250 ℃；载气为高纯He，恒流模式，流速为1 mL/min；初始温度 50 ℃，保留1 min，10 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，5 ℃/min 升至280 ℃，保持4 min，50 ℃/min升至300 ℃，保持2 min。进样量1 mL，进样方式为不分流。EI-MS分析条件：离子源温度280 ℃；电离能量70 eV；溶剂延迟时间4 min；电子轰击电离源（EI）。将得到的质谱数据对照标准谱库对虫茶香气成分进行确认。并用各香气组分的峰面积占总峰面积的比值表示各组分的相对含量。

1.3.3羟基自由基清除能力测定将6 mol/L脱氧核糖溶液0.2 mL、pH值7.4的磷酸钠缓冲溶液0.2 mL、400 mmol/L FeCl3溶液0.2 mL、400 mmol/L FeSO4-EDTA溶液0.2 mL、3 mol/L H2O2溶液0.2 mL、400 mmol/L 维生素C溶液 0.2 mL、0.2 mL虫茶香气物质溶液混合，在37 ℃水浴中放置 1 h，再加入1 mL三氯乙酸、1 mL 2-硫代巴比妥酸，将混合溶液在90 ℃水浴中煮沸20～25 min后在532 nm波长处测定吸光度，计算清除自由基能力[5]。

1.3.4DPPH自由基清除能力测定将不同浓度虫茶香气物质100 μL和0.15 mmol/L DPPH试剂60 μL混匀后，加入96孔板中室温下避光放置30 min，再在540 nm波长下测定吸光度。按下式计算清除DPPH自由基能力[6]：endprint

清除DPPH自由基能力=（对照值-对照空白值）-（样品值-样品空白值）对照值-对照空白值×100%。

式中：对照为没有加入样品孔，空白为加入样品但没有加入DPPH试剂孔。

1.3.5Ames抗突变试验虫茶香气物质提取物设2个试验剂量组（1.25、2.5 mg/皿）、自发回变组、对照组，每组设3 个平行皿。向灭菌试管中加入磷酸盐缓冲液、培养12 h后的 10亿～20亿个/mL的菌株0.1 mL、样品物质提取物溶液 50 μL、致突变物（MNNG）50 μL，轻微振荡后于37 ℃下放置30 min，加入顶层培养基2 mL混合，再倒在底层培养基上，37 ℃ 培养2 d，进行平板计数。按下式计算抑制率[7]：

抑制率=[（对照组菌落数-样品处理组菌落数）/（对照组菌落数-自发回变组菌落数）]×100%。

1.3.6MMT法测定虫茶香气物质提取物的体外癌细胞增殖抑制效果将AGS胃癌细胞和HT-29结肠癌细胞复苏后接种在含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，将癌细胞置于培养箱中以5%的CO2、37 ℃条件下培养，每周更换培养液2～3次并进行传代培养1次。按200 μL/孔将含癌细胞的培养液接种于96孔培养板中，培养液的癌细胞浓度为 1万个/mL，然后将96孔培养板放入培养箱中继续培养1 d，吸出96孔板中的培养液，加入虫茶香气物质提取物的培养液 200 μL。再经过2 d培养后，再次吸出各孔内上清液，再向各孔加入5 g/L MTT试剂200 μL后继续培养4 h，吸出各孔内的上清液，在每孔中加入200 μL DMSO后避光振荡 30 min，用酶标仪在540 nm波长下测定各孔吸光度，按下式计算细胞增殖抑制率[8]：

抑制率=[（空白孔吸光度值-样品孔吸光度值）/空白孔吸光度值]×100%。

1.4数据统计

试验数据均以“平均值±标准差”表示，各数据间差异显著性比较采用 SAS软件进行统计学检验。

2结果与分析

2.1虫茶香气成分的分析

通过GC-MS法分析（图1）可知，虫茶香气物质中主要含有5-乙基-2-oxa-1，3，4，5a，10-pentaazacyclopenta-[a]芴（5837 min）、癸烷（6.043 min）、（9-oxo-9，10-dihydroacridin-4-yl）乙酸（6.532 min）、7-氯-4-甲氧基-3-甲基喹啉（7.342 min）、1-（3-氢氧化-4 -甲苯基）-1，3，3，6-四甲基-5-茚满醇（9.826 min）、丙烯酮（11.454 min）、4-氨基苯乙烯酸（12.891 min）、草酰胺（12906 min）、缩水甘油（13.960 min）、2-乙酰基-1，3，3，4，4-五甲基环戊烯缩氨基脲（16.987 min）、棕榈酸（18.400 min）这11种化合物在虫茶中的含量分别为1353%、9.242%、7733%、2.280%、1.189%、2.508%、2981%、0.448%、0533%、1901%、1.566%。

2.2虫茶香气成分的抗氧化效果

通过测定虫茶挥发性物质提取物的羟基自由基、DPPH自由基清除能力可以判断虫茶香气物质的抗氧化效果。由图2、图3可知，在一定浓度范围内，随着虫茶挥发性物质提取物浓度的升高，虫茶挥发性物质提取物的羟基自由基、DPPH自由基清除能力均得到提高。已有研究表明，香气成分中的棕榈酸等物质具有抗氧化效果[9]，这些物质的存在使得虫茶香气成分具有抗氧化效果。

2.3虫茶香气成分的抗突变效果

MNNG是一种广泛存在的化学诱变剂和致癌剂，其引起的突变与肿瘤发生密切相关，通过体外抗突变试验可以从一定程度上判断食品的抗突变性[10]。

3结论

虫茶香气物质中主要含有11种成分，分别为5-乙基-2-oxa-1，3，4，5a，10-pentaazacyclopenta-[a]芴、癸烷、（9-oxo-9，10-dihydroacridin-4-yl）乙酸、7-氯-4-甲氧基-3-甲基喹啉、1-（3-氢氧化-4 -甲苯基）-1，3，3，6-四甲基-5-茚满醇、丙烯酮、4-氨基苯乙烯酸、草酰胺、缩水甘油、2-乙酰基-1，3，3，4，4-五甲基环戊烯缩氨基脲、棕榈酸。通过对虫茶香气物质清除羟基自由基和DPPH自由基的能力测定发现，虫茶香气物质具有一定的抗氧化能力，并且随虫茶挥发性物质提取物浓度的增大，抗氧化效果也增加。通过Ames抗突变试验检验虫茶香气物质对TA100沙门氏菌的增殖抑制作用，结果发现，虫茶香气物质显示出良好的抗突变效果。虫茶香气物质对AGS胃癌细胞、HT-29结肠癌细胞处理后，癌细胞的体外增殖都明显减少。成分分析试验和体外功能性效果试验证明，虫茶香气成分具有体外抗氧化、抗突变、抗癌效果，改进饮茶方式或加强工业茶饮料的制作工艺，保留虫茶香气成分，可以进一步利用虫茶的使用价值和保健价值。

参考文献：

[1]蒋三俊. 中国虫茶资源及其保健功用[J]. 特种经济动植物，2000，3（5）：36.

[2]陈晓阳，文礼章，李晟，等. 三叶虫茶对肾性高血压大鼠神经免疫调节作用的实验研究[J]. 湖南中医学院学报，2006，26（2）：4-6.

[3]戴素贤，谢赤军，袁学培，等. 苦丁茶香气的化学组成[J]. 华南农业大学学报，1998，19（1）：71-75.

[4]张莹，钟应富，袁林颖，等. 永川秀芽茶特征香气成分研究[J]. 西南农业学报，2012，25（6）：2046-2049.

[5]Kang H S，Chung H Y，Jung J H，et al. Antioxidant effect of Salvia miltiorrhiza[J]. Archives of Pharmacal Research，1997，20（5）：496-500.endprint

[6]Wang Q，Zhao X，Qian Y，et al. In vitro antioxidative activity of yellow tea and its in vivo preventive effect on gastric injury[J]. Experimental and Therapeutic Medicine，2013，6（2）：423-426.

[7]Zhao X，Ju J，Kim H M，et al. Antimutagenic activity and in vitro anticancer effects of bamboo salt on HepG2 human hepatoma cells[J]. Journal of Environmental Pathology Toxicology and Oncology，2013，32（1）：9-20.

[8]Zhao X，Kim S H，Yc Q，et al. Effects of different kinds of salt in comutagenicity and growth of cancer cells[J]. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition，2012，41（1）：26-32.

[9]李林强，李建科. 华山松籽油的成分分析及其抗氧化的研究[J]. 西北植物学报，2003，23（10）：1788-1791.

[10]Qian Y，Zhu K，Wang Q，et al. Antimutagenic activity and preventive effect of black tea on buccal mucosa cancer[J]. Oncology Letters，2013，6（2）：595-599.

[11]Khan J A，Jalal J A，Ioanndes C，et al. Assessment of the antimutagenic effect of Doash tea extract fractions[J]. Toxicology and Industrial Health，2012，28（10）：867-875.

[12]Zhao X，Deng X X，Park K Y，et al. Purple bamboo salt has anticancer activity in TCA8113 cells in vitro and preventive effects on buccal mucosa cancer in mice in vivo[J]. Experimental and Therapeutic Medicine，2013，5（2）：549-554.

[13]熊小琴，沈久明，梁峰.1-对甲苯磺酰基-3-羟基-1，5，8-三氮杂环癸烷的合成及抗肿瘤活性的初步研究[J]. 化学研究与应用，2011，23（4）：466-469.

[14]宋成荣，师伟，张琨，等. 1-（2-羟基-4，5-亚甲二氧基）苯基-2-甲基丙烯酮类化合物的合成及抑菌活性[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（1）：147-151.endprint