Aβ在两种阿尔茨海默病转基因小鼠模型脑杏仁核分布的比较研究

周 奕,邓志伟,艾卫敏,朱耀峰,张剑峰,卢 璨,雷德亮

(1.长沙卫生职业学院基础学科部，中国 长沙 410100；2.湘潭职业技术学院护理学院，中国 湘潭 411012；3.吉首大学医学院，中国 吉首 416000；4.中南大学湘雅医学院，中国 长沙 410013；5.中南大学基础医学院，中国 长沙 410013)

Aβ在两种阿尔茨海默病转基因小鼠模型脑杏仁核分布的比较研究

周 奕1,邓志伟1,艾卫敏2,朱耀峰3,张剑峰4,卢 璨4,雷德亮5*

(1.长沙卫生职业学院基础学科部，中国 长沙 410100；2.湘潭职业技术学院护理学院，中国 湘潭 411012；3.吉首大学医学院，中国 吉首 416000；4.中南大学湘雅医学院，中国 长沙 410013；5.中南大学基础医学院，中国 长沙 410013)

目的：比较研究Aβ在两种AD转基因小鼠模型脑杏仁核分布的差异．方法:采用18月龄雄性APP/PSl双转基因(2×Tg-AD) 小鼠与同龄同性别APP/PSl/tau三转基因(3×Tg-AD)小鼠，分别进行6E10单克隆抗体免疫组化染色等方法显示Aβ阳性神经元及斑块，观察其分布与形态等的差异，图像分析系统定量比较其量的变化．结果：在杏仁核2×Tg-AD组Aβ阳性产物主要位于细胞外成为细胞外Aβ(eAβ)，形成大量的Aβ阳性斑，Aβ阳性神经元少；而3×Tg-AD组 Aβ阳性产物主要位于神经元细胞内，成为细胞内Aβ(iAβ),但Aβ阳性斑少见．结论：2×Tg-AD组与3×Tg-AD组 Aβ阳性产物在杏仁核分布的差异可能反映了两种AD小鼠模型神经病理等改变的不同．

阿尔茨海默病；转基因小鼠；β淀粉样蛋白；杏仁核

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 临床上表现为：起病隐袭、进行性发展的记忆、言语、视空间、认知功能减退及人格的异常等[1-2]．其主要病变为：Aβ异常聚集和沉积形成老年斑(senile plaques，SPs)；颞叶、海马、杏仁核等部位神经元及突触丢失；tau异常磷酸化导致的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)和颗粒空泡变性(granulovacuolar degeneration，GD)等[3-5]．

AD的病因及发病机制复杂，有多种学说，至今仍未阐明．Aβ学说是目前普遍认同的AD主要发病机制之一：Aβ在脑内异常聚集并纤维化形成SPs，其神经毒性作用可破坏钙离子平衡、诱发氧化应激、激活小胶质细胞产生炎症反应、激活凋亡相关蛋白等启动凋亡程序并导致广泛的神经元丢失，进而形成认知功能损害，出现相应的痴呆症状[6-8]．用于AD研究的动物模型有很多种，且各具特点．其中过度表达人类家族性突变的APP基因和PS1基因的 2×Tg-AD 小鼠，以及过度表达APP、PS1和tau基因的 3×Tg-AD 小鼠均能模拟出AD的某些神经生物学特征性改变，然而针对这两种动物模型脑内重要区域Aβ分布的比较还未见报道．本研究通过Aβ单克隆抗体(6E10)免疫组化染色结合形态学分析等方法，比较18月龄 2×Tg-AD 与 3×Tg-AD 小鼠杏仁核中Aβ分布的差异，探讨两种AD小鼠模型病理形态等的不同．

1 材料与方法

1.1 实验动物

18月龄健康雄性2×Tg-AD小鼠8 只，含有突变的APPSwe/PS1△E9，由北京利昊生物科技有限公司提供．同龄雄性3×Tg-AD小鼠 8 只，含突变的APPSwe/PS1M146V/tauP301L，由美国国立卫生研究院Ingram博士资助．实验动物在SPF(Specific pathogen Free)级环境下饲养，严格控制温度、湿度、光照、换气条件等．高压灭菌的普通膳食喂养，定时称体质量，了解小鼠生长发育情况．

1.2 实验方法

1.2.1 组织制备 小鼠用质量分数为4%的水合氯醛按10 μL/g腹腔注射麻醉，仰卧位固定于实验台上．于上腹部剪开腹壁，向上紧贴剑突左侧剪破胸壁与膈肌，暴露心脏．在心尖剪一小口，迅速将灌注针经心尖送至升主动脉根部，随后剪开右心耳，可见血液快速流出．先用20～30 ℃ 0.9%的氯化钠溶液 20～30 mL快灌，可见肝脏颜色迅速变白，再用4 ℃的4%多聚甲醛磷酸缓冲液(Paraformaldehyde，PFA)(0.1 mol/L, pH=7.4)50～100 mL灌注，前1/3快灌，后2/3慢灌，使PFA充分渗透，维持30～40 min．灌注过程中可见小鼠尾巴抖动，四肢颤抖，并逐渐变硬．灌注完成后取脑，在4 ℃的 4%PFA中固定12 h，然后沉于30%的蔗糖溶液4 h．在 -20 ℃条件下作连续冠状切片，片厚 30 μm，收集杏仁核层面切片，待用．

1.2.2 免疫组化 Aβ单克隆抗体(6E10)进行ABC法免疫组织化学染色，主要过程如下：80%的甲酸修复抗原30 min；1%H2O215 min去除内源性过氧化酶干扰；0.5%Triton X-100 15 min以增加细胞膜通透性；5%的正常山羊血清封闭1 h；小鼠抗人6E10 单克隆抗体(1∶400)置4 ℃摇床12 h；生物素化山羊抗鼠IgG(1∶200)，室温摇床2 h；亲和素-生物素化酶(ABC)复合物(1∶150)，室温摇床上孵育 1.5 h；二氨基联苯胺(DAB)显色5 min，镜下观察并控制染色的强度．以上各步骤之间均用0.01 mol/L PBS漂洗 3 次，每次 5 min；明胶玻片贴片；自然干燥后，0.1%尼氏染液复染，梯度酒精脱水，二甲苯脱脂，明胶封片．

阴性对照：用0.01 mol/L PBS代替一抗，排除二抗的非特异性染色，结果为阴性．

1.3 数据收集和统计学处理

Motic-K400L显微镜在高倍视野(×60)下使用IPP软件计数杏仁核的相似视野中能够分清细胞轮廓的阳性细胞数，并取其均值．染色深度达到足以区分细胞周界的神经元被计数，全部计数均由一人采用盲法操作完成．每只小鼠脑组织检测3张切片，每张切片检测 3个视野．

HPIAS-1000H高清晰度彩色图像检测系统测定杏仁核区阳性表达产物的平均灰度值，同时测量各切片背景灰度值．免疫阳性灰度值=背景灰度值-免疫阳性产物平均灰度值．实验数据以均数±标准差表示．样本均数的比较采用完全随机设计的单因素方差分析并用SPSS V20.0统计软件进行统计处理．P<0.05为差异有统计学意义．

2 结果

2.1 形态学观察

2.1.1 Aβ阳性神经元 Aβ阳性神经元轮廓较清晰，细胞胞体较大呈圆形，胞浆中可见灰褐色的免疫阳性产物(即细胞内Aβ)．2×Tg-AD 组Aβ阳性的神经元数量极少，呈稀疏无规则散在分布；3×Tg-AD组可见大量密集分布的Aβ阳性神经元，且杏仁核中心区相对数目较多(Fig.1 A-D)．

2.1.2 Aβ阳性斑块 2×Tg-AD、3×Tg-AD小鼠脑内均可见Aβ阳性的黑褐色斑块(即老年斑SPs)．2×Tg-AD组Aβ阳性斑块染色较深呈散在分布，数量多、面积大；3×Tg-AD组斑块染色较淡，仅在杏仁核中心区呈点状分布(Fig.1 A-D)．

2.2 定量分析

2.2.1 Aβ阳性神经元 杏仁核2×Tg-AD组Aβ阳性细胞计数(个/视野)12±3.42与3×Tg-AD组Aβ阳性细胞计数28±6.38比较，差异有统计学意义(P<0.05)．2×Tg-AD组Aβ阳性细胞平均灰度值(MOD)179.12±3.98与3×Tg-AD组Aβ阳性细胞平均灰度值104.21±5.63比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)．

2.2.2 Aβ阳性斑块 杏仁核2×Tg-AD组Aβ斑占总面积(2.8±0.47)%；3×Tg-AD组Aβ斑占总面积(1.1±0.65)%.二者相比差异有统计学意义(P<0.05)(表1)．

表1 Aβ阳性神经元数、平均灰度值及Aβ斑在两种动物杏仁核的比较(*，P<0.05)

图1 6E10免疫阳性产物在杏仁核的分布A、B为2×Tg-AD组，C、D为3×Tg-AD组．图B、D (标尺=20 μm)取自于图A、C (标尺=100 μm) Fig.1 The distribution of 6E10 immunoreactive products in the amygdaleA and B for 2×Tg-AD, C and D for 3×Tg-AD. B and D (scale bar =20 μm) were taken from A and C (scale bar =100 μm)

3 讨论

本研究观察到2×Tg-AD组杏仁核可见大量6E10免疫阳性斑，这与其他研究者的报道是一致的[9-11]．说明在这类转基因AD小鼠模型中，细胞外Aβ(extracelluarβ-amyloid ，eAβ)的沉积是其主要的病变．eAβ在AD病理过程中的作用有较多研究报道，主要表现在以下几方面：(1)eAβ可诱发脑内免疫炎症反应．eAβ可激活小胶质细胞和补体系统，释放促炎因子，诱导炎症反应发生，从而导致神经元退行性变[12]．人们在AD患者脑中发现，在SPs的核心周围可见聚集的小胶质细胞并与SPs相互交错，小胶质细胞的异常激活同AD的神经病理改变有一定的联系，据此推测eAβ可能是通过免疫炎症反应促进AD的发生．临床流行病学调查表明，长期服用抗炎药物后AD发病率减低，并对认知功能具有保护作用．(2)Nelson 等发现eAβ可使某些抗氧化酶活性降低从而导致氧自由基的浓度异常升高，其可能是诱发AD的机理之一[13]．eAβ也可通过其它多种途径诱导蛋白质过氧化物、脂质过氧化物大量产生．这些产物的增加可导致神经元产能障碍，最终启动细胞的凋亡过程．(3)异常增加的eAβ的作用曾经被认为还通过多种方式尤其是诱发细胞凋亡的途径，从而引起神经元退行性变．支持该观点的依据有：与早期家族性AD相关的PS1、PS2、APP基因突变可使eAβ含量增加；Aβ降解酶基因的多态性，其中包括编码人胰岛素降解酶的基因，可能导致AD的发生；实验动物治疗研究发现抗-Aβ治疗有一定疗效．因此，清除eAβ及eAβ神经毒性，曾经是AD治疗的主要研究方向．然而，Aβ免疫实验仅起到轻微延缓AD进程的作用并出现了无菌性脑炎的严重副作用而被迫中断[14-16]．近年来，人们通过对AD转基因小鼠及AD病人的脑组织的研究，发现存在细胞内Aβ，并对AD病理的发展起重要作用．

作者在对3×Tg-AD组的研究中发现，eAβ阳性斑块小且少，而神经元内有很多6E10阳性产物即细胞内Aβ(intracelluarβ-amyloid ，iAβ)，这种现象还少见报道．近年来，神经元iAβ的存在与作用越来越受到人们的重视，其在AD中的作用也是多方面的：(1)iAβ可影响突触功能[17]．Meng等通过尸体解剖发现在AD的早期即出现明显的突触可塑性的改变[18]．Gimenez等发现3×Tg-AD转基因小鼠1到4个月时，皮质、杏仁核等部位的突触间传递丧失了近40%，而通过免疫组化等方式仅能检测到iAβ[19]．提示：AD早期在无细胞外斑块形成的情况下iAβ积聚，导致突触的损害．这可以解释老年斑形成和认知障碍之间的不一致性．(2)iAβ可导致线粒体受损[20]．线粒体通过氧化磷酸化作用产生能量物质ATP，同时参与维持正常的细胞内钙离子平衡．此外，线粒体在控制细胞凋亡中担当重要角色．线粒体的功能障碍会导致ROS产生过度和细胞色素C的释放，并将促使凋亡肽酶激活因子与细胞凋亡蛋白酶9-前原蛋白结合，启动凋亡过程．(3)ZHANG等通过对原代培养的人类神经元细胞内显微注射Aβ可出现P53和Bax蛋白介导的选择性杀伤作用[21-22]．(4)iAβ多肽与细胞内载脂蛋白E的聚集密切相关，而后者与DNA断裂和细胞溶解有紧密联系．(5)iAβ还可通过减低特异的蛋白磷酸酶活性和(或)增强糖原合成酶活性诱导tau蛋白的异常磷酸化，从而损伤神经元．此外，在自然衰老的恒河猴脑中，Aβ同样被发现于神经元和非神经元细胞内，早于淀粉样斑块的形成；同时证明Aβ寡聚体可以引发神经元退行性变[23]．

杏仁核(amygdale)是大脑边缘系统的重要组成部分，其具有调节内脏活动、处理情感反应及记忆等功能[24-25]．Horínek等通过MRI研究发现在AD的早期诊断中杏仁核与海马有着相同的诊断价值，并且认为两者在短期记忆过程中都担当着重要的角色；当AD出现轻微的精神症状时，杏仁核普遍发生了早期的损害[24]．Hampel等研究表明杏仁核不仅是AD脑内重要的病变部位之一，而且其Aβ异常沉积发生的时间可能比海马、皮质等区域更早[25]．上述研究表明杏仁核与AD有密切的关系．

作者比较了18月龄时2×Tg-AD与3×Tg-AD小鼠模型杏仁核Aβ分布特点．结果发现：2×Tg-AD组Aβ沉积主要发生在细胞外，3×Tg-AD组Aβ沉积主要发生在细胞内．在其他脑区也存在类似的表达差异．造成这种差异的原因目前还不清楚，有待深入研究．Aβ与AD的神经病理改变有着密切的关系，但Aβ如何引起神经元退行性变，其最初的作用位点是在细胞外还是细胞内，至今仍存在争议．由于3×Tg-AD小鼠过度表达的tau基因可能影响Aβ聚集的部位，并且3×Tg-AD小鼠早期即有明显的神经元死亡、突触丢失及学习记忆行为的改变[26]，据此作者推测iAβ的神经毒性可能在神经元退行性改变并导致AD发生的过程中发挥重要作用．

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(编辑 王 健)

Comparative Study on the Distribution of Aβin Amygdale of Two Transgenic Mice Models of Alzheimer’s Disease

ZHOUYi1,DENGZhi-wei1,AIWei-min2,ZHUYao-feng3,ZHANGJian-feng4,LUCan4,LEIDe-liang5*

(1.Basic Medical Department, Changsha Health Vocational College, Changsha 410100, China;2.School of Nursing, Xiangtan Vocational and Technical College, Xiangtan 411012, China;3.Medicine School of Jishou University, Jishou 416000, China;4.Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, China；5.Basic School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, China)

Objective:To compare the distribution and morphological features of Aβimmunoreactive products in the amygdale of two transgenic mice models of Alzheimer’s disease. Methods: 18-month-old APP/PSl(2×Tg-AD) and the age-matched male mice of APP/PSl/tau(3×Tg-AD) were used in this experiment. 6E10 immunohistochemical staining was used to show the distribution and morphological features of Aβimmunoreactive products，and quantitative analysis were made on the difference of the products by an image analysis system. Results:The deposition of Aβin the amygdala of 2×Tg-AD was mainly seen as extracellular Aβ(eAβ), and formed a lot of positive plaques; the positive products were distributed as intracellularly Aβ(iAβ) for the 3×Tg-AD, but the Aβpositive plaques were rarely seen. Conclusion:The difference of Aβpositive products distribution between the 2×Tg-AD and 3×Tg-AD is likely to be related to the difference of neuropathological changes of these two AD models.

AD; transgenic mice; Aβ; amygdale

2014-05-08

湖南省卫生厅科研基金课题资助项目(B2014-151)；湖南省教育厅科学研究资助项目(14C0091)；米塔尔学生创新资助项目(10MX19);长沙市2013年度指导性科技计划资助项目(K13ZD046-33)

*

,E-mail：delianglei@csu.edu.cn

R749.16

A

1000-2537(2014)05-0026-05