VEGF及DLL4在肝细胞癌中的表达及临床意义

杨 军,王连新,季 骊,周 健,倪立新

(江苏省启东市人民医院 启东肝癌研究所,江苏 启东,226200)

肝细胞癌(HCC)在全球范围内发病率和死亡率分别占恶性肿瘤发病和死亡的第5位和第3位[1],在中国是恶性肿瘤的第2位死因[2],是临床常见的恶性肿瘤之一，其手术后的高复发转移率是HCC患者死亡率居高不下的最主要原因[3]。HCC的复发和转移有赖于肿瘤新生血管的生长以供应营养[4]。目前，对肝细胞肝癌中血管生发的研究及作用机制的探索已成为一个热点[5]。血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤的生长、播散及转移过程中起着着极为重要的作用，可诱导肿瘤血管分化及形成，是参与血管生发和成熟的最重要的条件之一[6]。Delta-Notch信号通路尤其是其配体DLL4(Delta样配体4)被认为是调节肿瘤血管生发和成熟的另一个重要条件，使肿瘤血管的功能和结构得以优化，更有利于为肿瘤组织运输营养物质，且DLL4与VEFG相互影响形成反馈作用。本研究测定肝细胞肝癌组织中VEGF和DLL4的表达量，分析与肝细胞肝癌临床病理分期的关系及其临床意义，拟为肝细胞肝癌的抗血管生成靶向治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 病理及组织标本

收集启东市人民医院、启东肝癌研究所外科2010年1月— 2013年6月手术切除并经病理证实的肝细胞肝癌组织石蜡标本75例，全部病例术前均未接受肝动脉介入栓塞等治疗。其中男46例，女29例，年龄35～72岁，中位年龄53岁,<60岁48例,≥60岁27例。

1.2 主要试剂及方法

兔抗人DLL4 多克隆抗体(Abcam公司)、兔抗人VEGF单克隆抗体(北京中杉金桥生物有限公司)、SP免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)。染色步骤严格按照试剂盒说明书进行。用磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作为空白对照。

1.3 结果判定

所有的标本均通过2位病理医师进行评判。VEGF、DLL4以细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性染色。根据染色强度及阳性细胞比例进行评分。随机观察5个高倍镜视野，计数500个细胞，根据染色的细胞数目<5%为(-),5%～25%为(+),25%～50%为(2+)，50%～75%为(3+)，>75%为(4+)。(2+)及以上为阳性表达，用以计算阳性率。

1.4 统计与分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。采用χ2检验分析VEGF和DLL4在各临床病理数据中的表达情况。VEGF与DLL4表达的相关性采用Spearman等级相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 VEGF、DLL4在肝细胞癌及癌旁组织中的表达

75例肝细胞癌标本中，VEGF阳性颗粒主要定位于肿瘤细胞质,DLL4阳性颗粒主要定位于肿瘤细胞质和细胞膜，二者颗粒均呈棕黄色。在肝细胞肝癌组织中VEGF蛋白的阳性表达率为 64.0%(48/75),显著高于对照组的13.3%(4/30),差异有统计学意义(P<0.01)。DLL4蛋白在肝细胞肝癌组织中的阳性表达率为81.3%(61/75),显著高于对照组的23.3%(7/30),差异有统计学意义(P<0.01)。见图1、图2、表1。

图1 VEGF在肝细胞肝癌中的阳性表达 (SP 400倍)

图2 DLL4在肝细胞肝癌中的阳性表达 (SP 400倍)

2.2 VEGF及DLL4在肝细胞癌中的表达与临床病理参数之间的差异

VEGF及DLL4蛋白在肝细胞肝癌中表达与肿瘤结节数目(P<0.05)、脉管浸润(P<0.01)有关，各临床病理参数分组间差异有统计学意义(P<0.05); 而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、是否肝硬化、有无肿瘤包膜、肿瘤分化程度无关，各临床病理参数分组间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 VEGF和DLL4在肝细胞肝癌及癌旁肝组织中的表达情况[n(%)]

2.3 在肝细胞肝癌组织中表达的相关性

VEGF和DLL4的表达具有显著一致性，在VEGF阳性表达标本中的DLL4表达率明显高于VEGF阴性表达的标本,VEGF和DLL4在肝细胞肝癌组织中阳性表达水平呈明显正相关(r=0.217,P<0.05)。见表3。

表2 VEGF和DLL4的表达与各肿瘤临床病理参数之间的关系[n(%)]

表3 肝细胞肝癌中VEGF和DLL4表达的相关性

3 讨 论

肝细胞肝癌是死亡率较高的恶性肿瘤之一，其生长与血管生成密切关系，丰富的肿瘤血管为其生长提供充分的营养支持，为浸润播散及转移提供了营养保障。其中VEGF和DLL4-Notch信号通路相互作用，共同调控肿瘤血管生成，参与肿瘤发生发展。

VEGF是一种在细胞内合成的肝素结合糖蛋白，与细胞膜上硫酸类肝素蛋白多糖结合位点结合，经过蛋白水解作用后以二聚体形式分泌到细胞外，作用于血管内皮细胞，促进血管，包括肿瘤血管的形成及生长[7]。在肿瘤的生长及发展过程中，VEGF起着极为重要的作用，可促进肿瘤血管形成来输送各种营养物质及氧气，以满足肿瘤细胞生长需要，在肿瘤组织中有较高表达[6]。VEGF作用于内皮细胞上的特异性受体，促进血管内皮细胞的生成。另外VEGF还有利于肿瘤细胞脱落进入血循环或向临近组织扩散，有利于肿瘤的浸润生长及远处转移。本研究结果证实：VEGF蛋白在肝细胞肝癌组织中的阳性表达率明显高于正常肝细胞肝组织(P<0.01),提示VEGF的异常高表达促进了肝细胞肝癌中的血管生发，而在正常肝细胞肝组织的VEGF的表达水平并不能起促血管生发作用。同时，本研究证实VEGF蛋白的表达与肝细胞肝癌肿瘤的结节数目(P<0.05)、脉管是否浸润(P<0.01)有关，说明VEGF促进了肝细胞肝癌的浸润与播散。

Notch信号通路是公认的控制血管发育和病理血管形成的关键信号通路[8],而DLL4(Delta样配体4)是Notch受体的重要配体之一，其特异性表达于内皮细胞而引起关注。近年来有研究[9]表明,DLL4在膀胱癌细胞中高表达，在侵袭性膀胱癌中DLL4表达升高尤为显著。随后体外实验表明,DLL4不但调控胚胎血管的生成，还调控肿瘤血管的生长，而且影响肿瘤的生长和进展[10]。DLL4起初在胚胎发育时的动脉内皮细胞中被发现，随后研究发现,DLL4在血管前方的内皮尖端细胞主要表达于细胞膜[11]。本实验研究结果证实在肝细胞肝癌组织中DLL4蛋白的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.01),提示DLL4可能参与肝细胞肝癌的病程进展。本实验还证实,DLL4蛋白的表达与肝细胞肝癌的结节数目(P<0.05)、脉管是否浸润(P<0.01)有关，说明DLL4高表达促进肝细胞肝癌的侵袭。

VEGF与DLL4关系密切,DLL4-Notch信号通路受VEGF的调控，而DLL4对VEGF又具有反作用。Ridgway等[12]在一项裸鼠负瘤实验证实Notch/DLL4信号通路与VEGF之间存在“串话”(cross talk),阻断DLL4-Notch受体通路能导致大量无功能新生血管形成，这种阻断对存在耐受VEGF拮抗药的个体同样有效。Williams等[13]在血管内皮细胞中发现，VEGF可诱导尖端细胞表达DLL4,由此假设DLL4是VEGF的下游基因，与其一起作用调控萌发和分支的形态。DLL4与VEGF之间有一个负反馈作用，即VEGF上调DLL4的表达，而DLL4可能由其他途径压制血管内皮细胞对VEGF刺激的反应。本研究发现,VEGF和DLL4蛋白的表达呈显著正相关(r=0.217,P<0.05),说明VEGF与DLL4共同参与肝细胞肝癌的侵袭和转移。

目前肝细胞癌的血管靶向药物已应用于临床，贝伐单抗(Bevacizumab,Avastin)与VEGF单克隆IgG1抗体竞争结合，选择性地抑制VEGF,抑制新生血管形成。索拉非尼(Sorafenib,多吉美)通过靶向阻断Ras-Raf-MAPK通路上的Raf激酶，直接抑制肿瘤细胞增殖，同时还可抑制VEGFR-2、VEGFR-3、c-Kit等多种受体，以抑制肿瘤血管生成，起到抗血管生成和抗肿瘤细胞增殖的双重作用[14],在肝癌的晚期或辅助治疗中起了一定的作用。但由于部分HCC患者存在对该药的耐受，治疗效果不甚理想[15-16]。

迄今为止,HCC患者中DLL4与VEGF两者表达及相互关系的临床与实验研究报道不多。本实验对肝细胞肝癌组织中VEGF和DLL4蛋白水平进行了相关性分析，发现两者在肝细胞肝癌中表达水平呈显著正相关，提示两者在肝细胞肝癌的生长与扩散中起着协同作用。DLL4-Notch信号通路有望在VEGF之后成为肝细胞肝癌抗血管靶向治疗的又一个新靶点，联合作用于VEGF和DLL4有望增加靶向药物的疗效。

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