射干麻黄汤加味对哮喘小鼠肺组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响※

张 丽 赵 辉 季 辉 孙义田

(河北省沧州中西医结合医院肺病科，河北 沧州 061001)

实验研究

射干麻黄汤加味对哮喘小鼠肺组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响※

张 丽 赵 辉 季 辉 孙义田

(河北省沧州中西医结合医院肺病科，河北 沧州 061001)

目的探讨射干麻黄汤加味对慢性哮喘小鼠肺组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)表达的影响。方法将50只健康清洁级雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组、射干麻黄汤组及射干麻黄汤加味组，每组各10只。建立慢性哮喘小鼠模型后，各药物组分别予相应药物干预，正常对照组及模型组予0.9%氯化钠注射液腹腔注射。连续4周后取各组小鼠肺组织，采用免疫组织化学染色(SP法)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测小鼠肺组织内PPAR-γ的数量及转录表达情况。结果与正常对照组比较，模型组小鼠的PPAR-γ的数量及转录表达增加(P<0.05)，经地塞米松组处理后PPAR-γ的数量及转录表达有所降低(P<0.05)，而射干麻黄汤及射干麻黄汤加味组均有所增加(P<0.05)，射干麻黄汤加味组尤为明显(P<0.05)。结论射干麻黄汤加味可抑制BALB/c哮喘小鼠哮喘的发生，其机制有可能是通过升高PPAR-γ的数量及转录表达而实现的。

哮喘；疾病模型，动物；动物，实验；小鼠；射干麻黄汤；介子；地龙；过氧化物酶体增殖物激活受体

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ)是由配体激活的核转录因子，属于Ⅱ型核受体超家族成员。该受体活化后可以调控多种核内靶基因表达，具有多种生物学效应，特别是与哮喘患者气道炎症反应存在密切关联[1]。射干麻黄汤是传统中医治疗哮喘的常用方剂，我们通过临床反复对比、优化，发现射干麻黄汤加味治疗哮喘具有更加明显的疗效。本研究的目的在于探讨射干麻黄汤加味对于慢性哮喘小鼠肺组织PPAR-γ表达的影响，从而在分子水平探讨其防治哮喘的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性BALB/c小鼠50 只，6～8周龄，体质量(20±2)g，由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(黑)-2006009，饲养温度25.0～26.0 ℃，相对湿度60%～70%，昼夜明暗交替各12 h。

1.1.2 药物与试剂 射干麻黄汤(药物组成：射干15 g，麻黄9 g，生姜9 g，半夏9 g，紫菀6 g，款冬花6 g，五味子3 g，细辛3 g，大枣6 g)，生药由我院中药房提供，用蒸馏水1 000 mL先煎麻黄5 min后入余药，共水煎2次，然后过滤，浓缩为100 mL，每mL含生药0.66 g。射干麻黄汤加味为射干麻黄汤加芥子9 g、地龙6 g，生药由我院中药房提供，用蒸馏水1 000 mL先煎麻黄5 min后入余药，共水煎2次，然后过滤，浓缩为100 mL，每mL含生药0.81 g。腹腔致敏液(主要成分为卵蛋白10 μg及氢氧化铝20 μg，福州迈新生物技术开发有限公司)；地塞米松磷酸钠注射液(天津金耀氨基酸有限公司，国药准字H12020515)；PPAR-γ一抗(美国Santa Cruz公司)；SP免疫组化试剂盒(武汉博士生物工程德公司)；RT-PCR试剂盒(武汉博士生物工程德公司)；琼脂糖(哈尔滨晶美生物技术公司)；Trizol试剂盒(美国Invitrogen Corp公司)。

1.1.3 主要仪器 雾化吸入器(PW.1型，上海医疗器械厂有限公司)，自制玻璃雾化箱(50 cm×40 cm×25 cm)，全自动酶联免疫分析仪(Model550型，美国BIO-RAD公司)，定量PCR仪(ABI 7500型，美国ABI公司)，凝胶电泳成像系统(Gene Genius，美国Syngene公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 实验小鼠适应性饲养3 d后，随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组、射干麻黄汤组及射干麻黄汤加味组，每组各10只。除正常对照组外，其余各组小鼠于实验第1、15 d分别腹腔注射致敏液0.2 mL，第22 d开始于雾化吸入25 g/L卵蛋白，每日1次，每次30 min，连续4周建立哮喘动物模型。同时正常对照组予等容积0.9%氯化钠注射液雾化吸入。

1.2.2 给药方法 第22 d起，射干麻黄汤组及射干麻黄汤加味组小鼠在每次雾化吸入前 30 min分别予相应药液0.5 mL灌胃；地塞米松组予地塞米松注射液0.26 mL(含生药为0.65 mg/kg)腹腔注射；正常对照组及模型组予0.26 mL 0.9%氯化钠注射液腹腔注射，连续干预4周。

1.3 标本采集 末次雾化吸入24 h后以10%水合氯醛溶液400 mg/kg体质量腹腔注射麻醉后，迅速开胸，暴露气管、双肺，结扎右总支气管，于远端切下，右肺上叶放入10%中性甲醛溶液中，余放入液氮中保存。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 肺组织PPAR-γ表达 采用免疫组织化学染色(SP法)，石蜡切片，脱蜡至水，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性。微波抗原修复，然后按试剂盒说明书进行。以磷酸缓冲盐(PBS)代替一抗作为阴性对照。兔抗鼠PPAR-γ抗体工作浓度为1∶100。二氨基联苯胺(DAB)显色阳性结果呈棕黄色，计数阳性细胞数。

1.4.2 肺组织PPAR-γmRNA表达 采用RT-PCR技术检测，提取RNA；逆转录(RT)合成cDNA：按逆转录试剂盒进行；聚合酶链反应(PCR)，引物设计与合成：PPAR-γ和gapdh序列由Genebank获得，以Primer3软件设计引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司代为合成。

Gapdh：5'-ACCATAGTCCATGCCATCAC-3'

3'-TCCATCACCCTGTTGCTGTA-5'；

PPAR-γ：5'-GGTTGATTTTCTCAGCGTTTC-3'

3'-TCAATCGGATGGTTCTTCGA-5'。

依次加入正反引物各0.5 μL，cDNA产物1 μL，10×缓冲液2.5 μL，氯化镁2 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，Taq酶0.5 μL (1U)，加无RNA酶水至总容积为25 μL。震荡混匀放入定量PCR仪中，设置循环参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环后，72 ℃后延伸10 min，-20 ℃保存。将制好的1.5%琼脂糖凝胶置于电泳槽中，注入Tris-乙酸电泳液(稍高于凝胶层)。cDNA产物和6×上样缓冲液按5∶1混合后加入加样孔中，另加DNA marker。接通电流恒压电泳30 min。采用美国Gene Genius凝胶电泳成像系统测出目的基因和gapdh的表达强度，以同一标本的gapdh的产物积分光密度校正各自的目的基因的积分光密度值，并按公式相对值=目的基因表达强度/gapdh表达强度计算出相对值。

2 结 果

各组小鼠肺组织PPAR-γ阳性细胞数及PPAR-γmRNA表达比较 见表1、图1。

组 别nPPAR-γ阳性细胞数(个/mm2)PPAR-γmRNA表达正常对照组106．21±0．300．12±0．03模型组1010．30±0．66∗0．39±0．02∗地塞米松组107．32±0．46∗△0．24±0．06∗△射干麻黄汤组1011．95±0．40∗△#0．39±0．03∗△#射干麻黄汤加味组1012．57±0．45∗△#○0．55±0．06∗△#

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与地塞米松组比较，#P<0.05；与射干麻黄汤组比较，○P<0.05

图1 各组小鼠肺组织PPAR-γmRNA表达

A为正常对照组，B为模型组，C为地塞米松组，D为射干麻黄汤组，E为射干麻黄汤加味组

由表1、图1可见，与正常对照组比较，模型组、地塞米松组、射干麻黄汤组及射干麻黄汤加味组小鼠肺组织PPAR-γ数量及PPAR-γmRNA表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组PPAR-γ数量及PPAR-γmRNA表达明显减少(P<0.05)，射干麻黄汤组及射干麻黄汤加味组PPAR-γ数量及PPAR-γmRNA表达明显增加(P<0.05)；与射干麻黄汤组比较，射干麻黄汤加味组PPAR-γ数量及PPAR-γmRNA表达明显增加 (P<0.05)。

3 讨 论

射干麻黄汤是治疗冷哮的常用传统方剂。研究证实，该方可减轻气道炎症，降低气道高反应性[2]，并能延缓气道重塑进程[3]，无论对于一般的哮喘发作[4]还是咳嗽变异性哮喘[5]均具有较好的效果，为增加疗效其临床多灵活加减治疗。我们通过临床反复筛选优化发现，本研究中的射干麻黄汤加味效果颇佳。射干麻黄汤加味是在射干麻黄汤的基础上加芥子、地龙而成。芥子性味辛，温，入肺、胃经，利气豁痰，温中散寒，通络止痛，可治痰饮咳喘、胸胁胀满疼痛、反胃呕吐等。孙思邈载其“治咳嗽胸胁支满，上气多唾者，每日温酒吞下七粒”。《医学入门》中言及“利胸膈痰，止翻胃吐食，痰嗽上气”。地龙性寒，味咸，可清热、止喘、通络，归肝、胃、肺、膀胱经，功能清热平肝、熄风止痉、平喘、利尿、通络除痹。现代药理研究表明，地龙提取液具有良好的定咳平喘作用[6]。我们在治疗冷哮的温热药物中加入小剂量寒凉药物，即可防热药辛散太过，又可加强平喘之效。

PPAR-γ参与调控哮喘多种炎症细胞的功能及炎症基因的转录，作用机制复杂[7-9]。本实验通过观察射干麻黄汤加味对慢性哮喘小鼠肺组织PPAR-γ表达的影响，探讨其治疗哮喘的作用机制。实验结果发现，哮喘组肺泡区有大量的PPAR-γ阳性细胞(P<0.05)，PPAR-γmRNA表达强度明显增加(P<0.05)。地塞米松能明显下调肺组织PPAR-γ数量及PPAR-γmRNA表达(P<0.05)，但不能有效抑制气道炎症。而射干麻黄汤及其加味均可增强肺组织PPAR-γ阳性细胞数及PPAR-γmRNA的表达(P<0.05)。提示射干麻黄汤及其加味与地塞米松的作用机制不同。我们分析，哮喘时PPAR-γ的数量、转录是对气道内炎症反应的应答，目的在于阻止炎性细胞的激活，在使用射干麻黄汤及其加味后PPAR-γ的数量、转录表达进一步增强，从而调动了其阻止炎性细胞激活功能，最终也达到了抑制气道炎症的抗炎效果。

综上所述，射干麻黄汤加味可抑制BALB/c哮喘小鼠哮喘的发生，其机制有可能是通过升高PPAR-γ的数量及转录表达而实现的。同时，射干麻黄汤加味对PPAR-γ的数量、转录表达的影响大于射干麻黄汤组，从侧面也证实了中医辨证论治理论的正确性。

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[3] Woerly G，Honda K，Loyens M，et al.Peroxisome proliferators-activated receptors alpha and gamma down-regulate allergic inflammation and eosinophil activation[J].J Exp Med，2003，198(3)：411-421.

[4] Angeli V，Hammad H，Staels B.Peroxisome proliferators-activated receptorγinhibits the migration of dendritic cells：consequences for the immune response[J].J Immunol，2003，170(10)：5295-5301.

[5] 林永廉，林求诚.射干麻黄汤对实验性哮喘豚鼠嗜酸性粒细胞凋亡的影响[J].实用中医药杂志，2007，23(1)：3-5.

[6] 林建海，刘宝裕.平喘中药对致敏性喘豚鼠气道的作用[J].上海医学，1996，19(11)：638-641．

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(本文编辑：曹志娟)

StudyofSheganMahuangdecoctionontheexpressionofperoxisomeproliferator-activatedreceptorγinlungtissueofAsthmaticmice

ZHANGLi,ZHAOHui,JIHui,etal.

PulmonaryDiseaseDepartment,CangzhouHospitalsofTraditionalChineseandWesternmedicine,Hebei,Cangzhou061001

ObjectiveTo explore the effect of Shegan Mahuang decoction on the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR-γ) in lung tissue of Asthmatic mice.Methods50 healthy clean female BALB / c mice were randomly divided into normal control group, model group, Dexamethasone group, Shegan Mahuang decoction group and improved Shegan Mahuang decoction group, 10 mice in each group.After establishing a mouse model of chronic asthma, corresponding to each drug group were drug intervention, the normal control group and model group were 0.9% sodium chloride injection by intraperitoneal injection.After four consecutive weeks mice lung tissue of each group were taken, the number and the expression transcription of PPAR-γ in mouse lung tissue were detected using immunohistochemical staining (SP), RT-PCR technique.ResultsThe number and the expression transcription of PPAR-γ in mouse lung tissue in model group were increased as compared with those in normal control group (P<0.05).The number and the expression transcription of PPAR-γ were decreased after treatment of Dexamethasone (P<0.05).Those in Shegan Mahuang decoction group and improved Shegan Mahuang decoction group were increased (P<0.05).The increase in improved Shegan Mahuang decoction group was obvious (P<0.05).ConclusionShegan Mahuang decoction can inhibit incidence of asthma in BALB / c mice with asthma, the mechanism may be achieved by increasing the number of PPAR-γ expression and transcription.

Asthma; Disease models; Animal; Experiments; Mouse; Sheganmahuang decoction; Meson; Earthworm; Peroxisome proliferator-activated receptor

※ 项目来源：河北省中医药管理局2011年度中医药类科研计划课题(编号：2011161)

张丽(1981—)，女，主治医师，博士。从事呼吸科临床工作。研究方向：呼吸系统各种常见病、疑难病的中西医结合综合治疗。

R562.250.5；R289.5；R285.5

A

1002-2619(2014)06-0895-03

2013-07-15)