三参方对慢性萎缩性胃炎大鼠胃组织细胞凋亡及相关基因蛋白表达的影响

乔晓温，刘连臣，张彩侠，潘丽兰，李光荣，薛伟彩（.河北省辛集市中医院儿科，河北 辛集 060；.河北省任丘市卫生学校中医教研室，河北 任丘060；.河北省迁西县人民医院外科，河北 迁西0600；.河北工程大学附属医院儿科，河北 邯郸 0600；.河北省优抚医院内科，河北 石家庄 000；6.河北中医学院附属医院肛肠科，河北 石家庄000）

·论著·

三参方对慢性萎缩性胃炎大鼠胃组织细胞凋亡及相关基因蛋白表达的影响

乔晓温1，刘连臣2，张彩侠3，潘丽兰4，李光荣5，薛伟彩6*
（1.河北省辛集市中医院儿科，河北 辛集 052360；2.河北省任丘市卫生学校中医教研室，河北 任丘062550；3.河北省迁西县人民医院外科，河北 迁西064300；4.河北工程大学附属医院儿科，河北 邯郸 056002；5.河北省优抚医院内科，河北 石家庄 050051；6.河北中医学院附属医院肛肠科，河北 石家庄050011）

目的探讨三参方治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制。方法将实验大鼠60只随机分为正常组、模型组、三参方高剂量组、三参方低剂量组、维霉素组、三九胃泰组各10只，采用复合因素造模法复制大鼠慢性萎缩性胃炎模型，观察各组大鼠胃组织病理形态学、胃组织细胞凋亡，相关基因Caspase-3、Bcl-2和Fas蛋白表达的变化。结果模型组大鼠胃组织细胞凋亡指数（apoptotic index,AI）明显升高,Caspase-3和Fas蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱；三参方高剂量组、三参方低剂量组、维霉素组和三九胃泰组均能降低AI（P<0.01）；各治疗组均能升高G2/M 、S期百分数和细胞增殖指数（proliferation index，PI）（P<0.05）；三参方高剂量组、三参方低剂量组、维霉素组和三九胃泰组均能降低Caspase-3 PI和Fas免疫荧光指数（fluorescence index,FI）（P<0.05）；三参方高剂量组降低Fas FI较维霉素组和三九胃泰组更多（P<0.05）。结论三参方可通过调控Caspase-3、Bcl-2和Fas蛋白的表达，降低胃组织细胞凋亡率，该方可用于治疗慢性萎缩性胃炎。

胃炎,萎缩性；疾病模型，动物；细胞凋亡；基因

三参方为经多年临床筛选出的治疗慢性萎缩性胃炎（chronic atroghic gastritis,CAG）的经验方，具有益气养阴、柔肝健脾之功，取得了较好的临床疗效。实验表明，三参方能够促进胃动素和胃泌素的分泌释放，对胃黏膜具有保护作用[1-3]，本研究采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）观察三参方对CAG大鼠胃组织细胞凋亡、增殖及其相关调控基因Caspase-3、Bcl-2和Fas基因蛋白表达的影响，以研究三参方在治疗CAG方面的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源：Wistar大鼠，60只，雄性，体质量180～200g，购自河北省实验动物中心（合格证号：冀动字1001005）。

1.2 药物、试剂和仪器：三参方药物组成，党参、丹参、玄参、炒白芍、炒白术、炙甘草、清半夏、黄连、丁香、陈皮等，采用水煎和醇提取相结合方法，将提取液分别浓缩为含生药0.367g/mL、0.183g/mL浓度的水溶液。三九胃泰胶囊和维霉素片均用蒸馏水制成0.1g/mL浓度的混悬液。脱氧胆酸钠购自北京奥博星生物技术有限公司。Fas、Bcl-2和Caspase-3一抗单克隆抗体、二抗工作液（羊抗鼠PITC-IgG荧光抗体）均由美国Santa Cruz公司提供。Epics-XLⅡ型流式细胞仪由美国Beckman Coulter公司生产。

1.3 动物分组与造模：将实验大鼠常规喂养1周后，随机分为正常组、模型组、维霉素组、三九胃泰组、三参方低剂量组、三参方高剂量组，共计6组，每组10只。动物造模参照相关文献采用的方法[4]，即先灌饲0.2%脱氧胆酸钠溶液，每只用量为1.5mL/d，5h以后，再灌饲50℃热水，每只用量为2mL/d，同时加用饥饱失常的喂养方法（2d足量喂食，1d停食），正常组大鼠普通饲料喂养，每天灌饲等量的蒸馏水，造模时间共8周。

1.4 给药方法：造模成功后，开始灌胃治疗，其中三参方低剂量组和高剂量组分别按照1.83g/kg、3.67g/kg的剂量灌胃，维霉素组和三九胃泰组均按照1g/kg的剂量灌胃，正常组和模型组均给予等剂量的蒸馏水灌胃；1次/d，用药体积均按照1mL/100g计算。

1.5 胃组织样本制作：治疗5周后，麻醉实验大鼠，股主动脉取血后，迅速剖开腹部，分离胃组织，沿胃窦近幽门口至胃大弯方向取适量的胃组织，于生理盐水中冲洗后，以70%乙醇溶液固定，置于冰箱中冷藏待检。

1.5.1 制备单细胞悬液：将固定的胃组织放置于100目的不锈钢网上，网下置一平皿，用剪刀剪碎至1mm3大小，再用眼科镊子轻搓组织块，边搓边以PBS液冲洗，直至将组织搓完。然后将平皿中的混悬液，用300目筛网过滤以去除细胞团块，收集细胞悬液，500～800r/min离心2min，弃去上清，保留沉淀，加入PBS 0.3mL，稀释混匀后，将单细胞悬液分成4份，调整每份的细胞数为1×106，分别用于检测细胞凋亡，以及Caspase-3、Bcl-2和Fas蛋白表达。

1.5.2 细胞凋亡DNA含量染色：取1×106细胞悬液0.1mL，加入10%鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，加入碘化丙啶1mL，在4℃冰箱染色30min，以500目铜网过滤，上机检测。

1.5.3 Caspase-3、Bcl-2、Fas蛋白免疫荧光标记：将鼠抗人单克隆抗体工作液0.1mL，加入到单细胞悬液1×106/mL中，室温孵育30min，加入PBS 10mL洗涤1次，弃去上清液，加入羊抗鼠PITC-IgG二抗工作液100μL，室温孵育30min，加入PBS 10mL离心，弃去上清，除去未结合的荧光二抗，再加入PBS 0.1mL并用500目的铜网过滤后，即可上机检测。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底作为对照和阴性对照。

1.5.4 检测方法：应用Epics-XLⅡ型流式细胞仪，检测前以flow-check TMF luorpheres（10μm）荧光微球作为标准样品调整仪器变异系数在2%以内。

1.6 测量资料分析方法：应用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期拟合分析，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，以细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）表示细胞凋亡程度，细胞增殖指数（proliferation index，PI）代表细胞的增殖活性，免疫荧光指数（fluorescence index，FI）表示蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 各组对CAG大鼠胃组织细胞凋亡的影响：与正常组比较，模型组AI明显升高（P<0.01）；G2/M期、S期细胞百分率和PI明显降低（P<0.01）；三参方高剂量组、三参方低剂量组、维霉素组和三九胃泰组均能降低AI（P<0.01），三参方高剂量组降AI值最多，维霉素组降AI值最少，但各治疗组之间差异无统计学意义；各组对升高G0/G1的影响差异无统计学意义（P>0.05）；各治疗组均升高G2/M、S期百分数和PI值（P<0.05），各治疗组之间对G2/M和PI值的影响差异无统计学意义（P>0.05），但三九胃泰组对升高S期百分数不如三参方低剂量组（P<0.05）。见表1。

组别AIG0/G1（%）G2/M（%）S（%）PI正常组10．31±1．5175．68±6．249．51±0．6614．42±1．5523．96±2．46模型组24．46±3．12∗80．89±8．857．73±0．88∗11．28±0．92∗18．96±1．83∗三参方高剂量组14．55±2．78∗#73．21±7．7111．55±1．75∗#15．16±1．16#26．59±2．37#三参方低剂量组15．84±3．03∗#74．48±8．9211．41±1．92∗#15．38±0．52#26．81±3．02#维霉素组17．83±2．89∗#75．83±6．8410．82±1．52∗#14．18±1．73#24．92±2．63#三九胃泰组17．41±3．88∗#75．49±5．6511．16±1．28∗#13．69±0．88#△24．89±1．13# F24．9211．23111．09515．22415．176 P0．0000．3070．0000．0000．000

*P<0.05与正常组比较 #P<0.01与模型组比较 △P<0.05 与三参方高剂量组比较（SNK-q检验）
AI：apoptotic index；PI：proliferation index

2.2 各组对CAG大鼠胃组织细胞Caspase-3、Bcl-2、Fas蛋白表达的影响： 与正常组比较，模型组大鼠Caspase3 FI和Fas FI均升高（P<0.05），而Bcl-2蛋白表达FI值降低（P<0.05），三参方高剂量组、三参方低剂量组、维霉素组和三九胃泰组均能降低Caspase-3 FI和Fas FI（P<0.05）；三参方高剂量组降低Fas FI较维霉素组和三九胃泰组更多（P<0.05）；三参方高剂量组、三参方低剂量组、维霉素组和三九胃泰组均能升高Bcl-2 FI，各治疗组间差异无统计学意义（P>0.05），但三参方高剂量组最接近正常组。见表2。

组别Caspase⁃3FIFasFIBcl⁃2FI正常组1．03±0．010．83±0．131．0±0．15模型组1．32±0．03∗1．28±0．21∗0．74±0．21∗三参方高剂量组1．06±0．02∗#0．89±0．12∗0．98±0．19#三参方低剂量组1．07±0．03∗#1．08±0．23∗0．95±0．11#维霉素组1．18±0．03∗#△1．12±0．21∗△0．92±0．08#三九胃泰组1．16±0．02∗#△1．06±0．18∗△0．97±0．11# F192．4447．7664．099 P0．0000．0000．003

*P<0.05 与正常组比较 #P<0.01与模型组比较 △P<0.05与三参方高剂量组比较（SNK-q检验）
FI：fluorescence index

3 讨 论

中医学中无CAG的病名，根据其临床表现可归属于中医的“胃痞、胃脘痛”等疾病范畴[5]，究其病因多是由于饮食不节、饥饱寒温失常，或郁怒伤肝、所欲不遂、肝失疏泄、克伐脾胃，或操劳过度、调摄失宜、损伤脾胃等，渐致脾胃气虚阴亏，气机失于调畅。本病的病位虽在胃，但脾与胃相为表里，相互为用，功能紧密相关；肝司疏泄之职，有助脾胃气机的升降。在治疗上既要注意健脾和胃、益气养阴，又要注意疏畅肝气。故三参方中选用党参、炒白术补气健脾；玄参濡养胃阴；炒白芍、炙甘草酸甘化阴，柔肝和胃；陈皮、丹参调畅胃经气血；清半夏、丁香、黄连辛开苦降，通降胃气。诸药合用，脾胃得键，气阴得充，气机得畅，故治疗CAG可获得满意的疗效。

本研究中模型组大鼠AI值、Caspase-3 FI和Fas FI明显升高，G2/M、S、PI和Bcl-2 FI明显降低，三参方高剂量组、三参方低剂量组、维霉素组和三九胃泰组均能降低模型组的AI，但以三参方高剂量组降低AI效果最好；三参方高剂量组、三参方低剂量组、维霉素组和三九胃泰组均能升高模型组G2/M、S、PI，但最接近正常组的是维霉素组，以三参方高剂量组升高G2/M的最多，三参方低剂量组升高S和PI最多，各组对G0/G1的影响不大；各治疗组均能降低Caspase-3 FI和Fas FI，升高Bcl-2 FI，但最接近正常组的是三参方高剂量组。

胃组织细胞的过度凋亡，可严重影响胃的生理功能。Bcl-2与Fas是与细胞凋亡关系较为密切的基因，两者的作用各不相同。Bcl-2基因主要作用是通过抗细胞凋亡，以延长细胞寿命，促进细胞生存[6-8]。Fas基因为细胞膜表面受体蛋白，它是与T淋巴细胞膜上Fas-L结合，向细胞内传递“死亡信号”，诱导靶细胞发生凋亡[9]。Caspase-3是Caspase家族成员之一，是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，Caspase-3介导的凋亡在人体多种类型细胞中普遍存在，其降解凋亡标志性底物的活性最强；Caspase-3可被该家族其他成员如Caspase-9和Caspase-6激活。Bcl-2，Bcl-xL等抗凋亡蛋白可通过与Fas等促凋亡蛋白形成异二聚体阻止线粒体释放细胞色素C，或直接与a-paf-1、Caspase-9结合成三元复合物从而阻止Caspase-9途径的激活，Caspase-3不能被活化，因而细胞凋亡受抑制[10]。本研究结果表明，模型组大鼠的胃组织中细胞凋亡率最高，同时Bcl-2表达量最低，Caspase-3和Fas表达量最高；说明Caspase-3和Fas表达上调、Bcl-2表达下调，是造成细胞凋亡增加的原因之一。经药物治疗后，与模型组相比，各治疗组Caspase-3和Fas表达量明显降低，Bcl-2表达量明显增加，细胞凋亡率明显下降；说明三参方能够加速胃组织细胞的DNA合成及分裂增殖，抑制胃组织细胞过度凋亡，以保证胃组织细胞的正常功能，从而达到抗CAG的作用，此可作为三参方治疗CAG的作用机制之一。

[1] 屈树行,张治秋,高玮,等.三参方对慢性萎缩性胃炎大鼠治疗作用的实验研究[J].河北中医药学报,2011,26（3）：5-6.

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（本文编辑：许卓文）

2013-11-18；

2014-04-13

乔晓温（1979-），女，河北辛集人，河北省辛集市中医院主管护师，从事儿科疾病护理研究。

R573.32

B

1007-3205（2014）05-0561-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.021

*通讯作者