表没食儿茶素没食子酸酯对帕金森病大鼠的神经保护作用及其机制探讨

吴艳芬，刘汉杰，张延平，王 伟*（.河北省邯郸市第一医院内分泌科，河北 邯郸 05600；.河北医科大学第二医院神经外科，河北 石家庄 050000；.河北省邯郸市第一医院神经内科，河北 邯郸 05600）

·论著·

表没食儿茶素没食子酸酯对帕金森病大鼠的神经保护作用及其机制探讨

吴艳芬1，刘汉杰2，张延平3，王 伟3*
（1.河北省邯郸市第一医院内分泌科，河北 邯郸 056001；2.河北医科大学第二医院神经外科，河北 石家庄 050000；3.河北省邯郸市第一医院神经内科，河北 邯郸 056001）

目的观察表没食儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对鱼藤酮致帕金森（Parkinson disease,PD）大鼠模型黑质多巴胺能神经元的保护作用。方法健康成年雄性Wistar大鼠60只，随机分为对照组、实验组和药物干预组（每组20只）。实验组和药物干预组背部皮下注射鱼藤酮制备PD大鼠模型，药物干预组同时给予大鼠腹腔注射EGCG。采用分光光度法检测大鼠脑内丙二醛（malondialdehyde,MDA）和还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH），免疫组织化学和Western blot检测大鼠中脑黑质及纹状体中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表达变化。结果实验组大鼠纹状体中MDA明显增高（P<0.05），GSH含量明显降低（P<0.05），中脑TH免疫反应阳性神经元数明显少于对照组（P<0.05）,TH蛋白在黑质和纹状体与对照组比较明显降低（P<0.05）；EGCG干预后与实验组相比MDA明显降低及GSH明显增高（P<0.05）,TH免疫反应阳性神经元数明显增加（P<0.05）,TH蛋白明显增加（P<0.05）。结论化应激在PD发病中起着非常重要的作用，抗氧化治疗能有效减轻大鼠脑内多巴胺能神经元损伤情况，同时改善PD样症状，为PD的治疗提供了新的靶点。

帕金森病；表没食儿茶素没食子酸酯；多巴胺

帕金森病（Parkinsondisease，PD）是发生在中老年人群中较为常见的中枢神经系统退行性疾病，其特征性病理变化是黑质多巴胺能神经元变性坏死及Lewy小体形成导致黑质纹状体通路破坏及尾状核、壳核中多巴胺含量减少，临床主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高等[1]。最近的研究[2]结果显示氧化应激损害在PD黑质多巴胺神经元死亡过程中起着非常重要的作用。抗氧化治疗PD已成为新疗法中的重要研究方向。表没食儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）是从天然植物茶叶中分离提纯出来的多酚类化合物复合体茶多酚的重要成分，EGCG具有良好抗氧化效应，在许多神经变性疾病中显示出神经保护作用[3]。本研究观察EGCG对鱼藤酮制备PD动物模型脑内多巴胺能神经元的保护作用，为PD治疗提供一个新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和动物模型的制备：Witstar大鼠60只，雄性，体质量250～300g，由河北省实验动物中心提供。将动物随机分为对照组、实验组和药物干预组；对照组20只背部皮下注射葵花油1mL/kg，实验组和药物干预组各20只，按照2.0mg·kg-1·day-1背部皮下注射鱼藤酮（鱼藤酮溶解在葵花籽油中，充分振荡混匀后4℃避光保存），其中药物干预组在鱼藤酮注射前半小时给予EGCG50mg·kg-1·day-1腹腔注射，共30d。饲养于昼夜交替的环境中，其间所有大鼠自由进食水。

1.2 脑组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量测定：大鼠直接断头取脑，迅速分离纹状体，液氮速冻，-80℃保存，用于测量MDA和GSH，具体实验方法按所购试剂盒说明书进行。

1.3 免疫组织化学染色：大鼠深度麻醉下以4%多聚甲醛（4℃）经心灌注固定,取脑固定4h,30%蔗糖液4℃过夜。所需部位冠状位冷冻连续切片（厚40μm）,间断集片,磷酸缓冲液洗片后行免疫细胞化学反应。相关切片分别以小鼠抗酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase,TH）单克隆抗体（1∶3 000,Sigma）4℃孵育切片48h;生物素化羊抗小鼠IgG（1∶500）室温孵育切片2h,1∶500HRP链霉卵白素室温孵育1h。每步中间以Tris缓冲液洗片。二氨基联苯胺（diaminobenzine,DAB）呈色、贴片、封片、观察。以正常羊血清代替一抗,作为阴性对照。

1.4 细胞计数：在光镜40倍物镜下,按James等方法,分别计数相关核团1cm2面积TH（黑质致密部）免疫反应阳性神经元数目。

1.5Westernblot：大鼠快速断头取脑,置于冰板上选取黑质及尾壳核所在脑块,入液氮速冻后入低温冰箱备用。取所需脑组织入4℃裂解液匀浆5min,冰浴静置1h,4℃离心,取上清,Bradford法测定蛋白浓度。相关样品取50μg总蛋白经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离,电转移至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭2h后,依照实验目的分别加入5%脱脂奶粉稀释的小鼠TH单克隆抗体（1∶10 000）,4℃过夜。聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜以Tris缓冲液洗3次。羊抗小鼠IgG荧光抗体（1∶10 000，Rocland公司）室温避光1h，漂洗5次，远红外荧光扫描成像系统（Odyssey公司）扫描并测定目标蛋白单位光密度值，与β-actin（1∶5 000，SantaCruz）比值后，做统计学分析。

2 结 果

2.1 一般状况：与对照相比较,实验组大鼠有主动活动减少、动作迟缓、步态不稳、不能直线行走、行走时多向一侧旋转的行为表现;毛色变黄变脏,体态呈弓背状。药物干预组大鼠的上述症状有明显改善，向一侧旋转的症状明显减轻。

2.2 免疫组织化学结果：实验组大鼠黑质TH阳性神经元数目较对照组明显减少（P<0.05）;药物干预组黑质TH阳性神经元数目较实验组明显增高（P<0.05），但较对照组仍有明显减少（P<0.05）。见表1。

2.3Westernblot结果：实验组大鼠TH蛋白在黑质及尾壳核比对照组明显减少（P<0.05）；药物干预组TH蛋白在黑质及尾壳核较实验组明显增高（P<0.05）,但是较对照组仍有明显减少（P<0.05）。见表1。

2.4 大鼠纹状体中氧化应激参数的改变:实验组大鼠纹状体中GSH的含量比对照组明显减少（P<0.05）；药物干预组GSH明显增加（P<0.05）,但较对照组仍明显减少（P<0.05）。实验组脂质代谢产物MDA含量较对照组明显增加（P<0.05）；药物干预组MDA明显减少（P<0.05）,但较对照组仍明显增高（P<0.05）。见表1。

GroupsTHpositiveneuronsinSN（number）TH/β⁃actininSNTH/β⁃actininstriatumMDAinstriatum（nmol/mg）GSHinstriatum（mg/g）Control34．35±4．040．75±0．070．64±0．025．21±1．5543．73±4．58PD20．27±3．05∗0．45±0．08∗0．39±0．05∗19．13±2．04∗28．40±2．61∗EGCG+PD25．97±3．02∗#0．59±0．01∗#0．51±0．03∗#10．24±3．21∗#35．42±3．21∗#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vsPD group byqtest
PD：Parkinson disease；TH：tyrosine hydroxylase；SN：substantia nigra；MDH：malondialdehyde；GSH：glutathione

3 讨 论

PD是最常见的神经变性病之一，其病理改变主要是黑质内多巴胺能神经元渐进性受损。氧化应激参与脂质过氧化，导致体内氧自由基过度蓄积，可能是引起黑质多巴胺能神经元损伤的重要原因之一，从而促进PD的病理过程,PD患者脑内氧化应激损伤包括脑内脂质过氧化增加、还原性谷胱甘肽耗竭及DNA损害等[4-6]，这些均提示氧化应激在PD多巴胺能神经元损伤过程中发挥着一定的作用，因此抗氧化治疗是延缓疾病进展的一条途径。本研究发现鱼藤酮处理后大鼠脑内发生了明显的氧化应激，脂质代谢产物MDA含量明显增高，同时自由基清除剂GSH含量明显降低,表明纹状体中氧化平衡被破坏，发生了氧化损伤。鱼藤酮是一种源于某些植物根茎一直被视为安全的广泛应用于果蔬除害等方面的天然杀虫剂。鱼藤酮对黑质多巴胺能神经元具有明显的神经毒性作用[7]，接触鱼藤酮的大鼠可出现PD样症状及帕金森病理性改变[8]。鱼藤酮为制备PD动物模型的有效药物，本研究中也发现鱼藤酮能导致大鼠脑内氧化应激及多巴胺能神经元损伤，同时也证明了氧化应激在PD的发病中起着非常重要的作用。这也为临床上对PD患者抗氧化治疗提供了理论依据。

EGCG是从绿茶中提取出来的多酚类化合物，其酚羟基是天然的供氢体，能够提高内源性抗氧化酶生成，在体内外均具有很强的清除自由基和抗氧化的功能[9]。最近研究[10]表明，EGCG具有多种药理学作用，如较强清除自由基、抗脂质过氧化、抗凋亡、抗病毒、预防癌症和心脏病等。氧化应激与PD病理机制密切相关，饮食来源可能成为预防和治疗PD有效的抗氧化剂替代品。本研究结果显示，鱼藤酮背部皮下注射可以导致大鼠脑内氧化应激及多巴胺能神经元损伤而出现PD样症状，给予大鼠EGCG，通过降低黑质多巴胺能神经元脂质过氧化状态，调节抗氧化蛋白酶的活性，增加总蛋白的合成能力，减少神经细胞的损伤，可改善大鼠PD样症状，抗氧化治疗可能是PD治疗的新靶点。

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（本文编辑：赵丽洁）

MECHANISMOFEPIGALLOCATECHIN-3-GALLATENEUROPROTECTIONINPARKINSONDISEASERATSINDUCEDBYROTENONE

WUYanfen1,LIUHanjie2,ZHANGYanping3,WANGWei3*
（1.DepartmentofEndocrinology,theFirstHospitalofHandanCity,HebeiProvince,Handan056001,China；2.DepartmentofNeurosurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;3.DepartmentofNeurology,theFirstHospitalofHandanCity,Handan056001,China）

ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofepigallocatechin-3-gallate（EGCG）onthesubstantianigradopaminergicneuroninParkinsondisease（PD）ratsinducedbyrotenone.MethodsThehealthyadultmale60Wistarratswererandomlydistributedtothefollowinggroupscontrolgroup,PDgroupanddrugtherapygroup（n=20eachgroup）,PDanddrugtherapygroupswereinjectedsubcutaneouslyrotenoneinthebacktopreparethePDratsmodel,theratsofdrugtherapygroupwereinjectedintraperitoneallyEGCGatthesametime.Spectrophotometrywasusedtodetectoxidativestressparametersinrats（malondialdehydeandglutathione）,immunocytochemistryandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionoftyrosinehydroxylase（TH）inthesubstantianigraandstriatumofrats.ResultsMalondialdehyde（MDA）wassignificantlyhigher（P<0.05）,andglutathione（GSH）wassignificantlydecreased（P<0.05）intheratsstriatumofrotenonegroupthanthoseofcontrolgroup.ThenumberofTHpositiveneuronsinmidbrainwassignificantlylessthanthatofcontrolgroup（P<0.05），buttheexpressionofTHwassignificantlydecreasedinthesubstantianigraandstriatumcomparedwithcontrolgroup（P<0.05）;MDAobviouslydecreasedandGSHincreasedsignificantlyaftertheinterventionofEGCGcomparedwiththatofrotenonegroup（P<0.05）,thenumberofTHpositiveneuronssignificantlyincreased（P<0.05）andTHproteinincreasedsignificantly（P<0.05）.ConclusionOxidativestressplaysaveryimportantroleinthepathogenesisofPD,anti-oxidationtreatmentcaneffectivelyreducetheinjuryofdopaminergicneuronsinthebrainofrat,whichprovidesanewtargetforthetreatmentofPD.

Parkinsondisease;epigallocatechin-3-gallate;dopamine

2013-02-21；

2013-03-26

河北省科学技术研究与发展指导计划项目（132777134）

吴艳芬（1978-），女，河北邯郸人，河北省邯郸市第一医院主治医师，医学硕士，从事内分泌疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail:sunnywangwei@163.com

R743

A

1007-3205（2014）05-0501-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.003