LRIG3反义寡核苷酸对宫颈癌Hela229细胞LRIG3、EGFR表达及增殖的影响

郭历琛，史惠蓉，盛浴澜，张平安，张 锐

1)郑州大学第一附属医院妇产科 郑州 450052 2)上海市嘉定区中心医院妇产科 上海 201800

LRIG3反义寡核苷酸对宫颈癌Hela229细胞LRIG3、EGFR表达及增殖的影响

郭历琛1,2)，史惠蓉1)#，盛浴澜2)，张平安2)，张 锐2)

1)郑州大学第一附属医院妇产科 郑州 450052 2)上海市嘉定区中心医院妇产科 上海 201800

#通讯作者，女，1959年12月生，博士，教授，主任医师，研究方向：妇科肿瘤,E-mail:Hrshi2011@163.com

LRIG3；反义寡核苷酸；EGFR；增殖；宫颈癌

目的：探讨LRIG3反义寡核苷酸(ASODN)对宫颈鳞癌Hela229细胞LRIG3、EGFR表达及增殖的影响。方法利用阳离子脂质体介导法分别用150、200及250 mg/L的LRIG3 ASODN、正义寡核苷酸(SODN)及无关序列核苷酸(MSODN)转染Hela229细胞24、48及72 h，分别应用RT-PCR和Western blot法检测细胞LRIG3、EGFR mRNA及蛋白的表达情况，应用MTT法检测细胞增殖率。 以常规培养的细胞作空白对照。结果转染24、48、72 h后，ASODN组细胞增殖率均较空白对照组、SODN组、MSODN组明显增高(P<0.05)，LRIG3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)，EGFR mRNA和蛋白表达增高(P<0.05)；3个ASODN剂量组间比较，随着LRIG3 ASODN剂量的增加，细胞增殖率增高(P<0.05)，LRIG3 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)，EGFR mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论LRIG3 ASODN可促进宫颈鳞癌Hela229细胞的增殖，该效应可能与抑制LRIG3表达、促进EGFR表达有关。

在全球范围内，宫颈癌发病率仅次于乳癌，且出现患者年轻化的趋势，传统的手术治疗和放化疗有着很大的局限性，特别是对于局部晚期宫颈癌患者治疗效果不甚令人满意。随着分子生物学和免疫学技术的发展，从基因层面治疗宫颈癌已逐渐成为新的研究方向。分子靶向治疗具有副作用小、专一性高等优点，其中反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASODN)技术有着靶向性强、可控、易操作等优点。具有亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域(the leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains，LRIG)是一组最近发现的转膜蛋白，被称为LRIG基因家族，该家族共有3个成员，即LRIG1、LRIG2和LRIG3[1-4]。LRIG1是最先发现的家族成员，最近的研究[5]证实LRIG1可以抑制肿瘤的恶化和增生。LRIG3与LRIG1的组成结构较为相似，可能有着与LRIG1相似的功能[6]。作者观察了利用ASODN技术抑制LRIG3表达对宫颈鳞癌Hela229细胞增殖的影响，为宫颈鳞癌的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料及主要试剂Hela229细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，细胞用含体积分数10%胎牛血清(美国Gibco公司)的RPMI 1640完全培养基在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。Trizol为MRC公司产品，MTT、DAB显色剂为美国Sigma公司产品，Taq酶、逆转录试剂盒购自大连TaKaRa公司，鼠抗人LRIG3单克隆抗体、兔抗人LRIG3多克隆抗体、兔抗人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)多克隆抗体、鼠抗人EGFR单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2LRIG3反义寡核苷酸的合成应用RNA structure3.5对LRIG3的二级结构进行模拟，针对LRIG3 mRNA设计一条ASODN、一条正义寡核苷酸(SODN)、一条无关序列(MSODN)。3条序列皆进行硫代修饰，由上海生工生物技术服务有限公司合成，-20 ℃保存备用。LRIG3 ASODN序列：5’-GGT CTCCAATTCATTGTTGT-3’；LRIG3 SODN序列： 5’-ACAACAAUGAAUUGGAGACC-3’；LRIG3 MSODN序列：5’-TTAGCTTTGCTGGATGTCAG-3’。

1.3实验分组利用阳离子脂质体介导法分别将150、200、250 mg/L的LRIG3 ASODN、SODN和MSODN体外转染Hela229细胞24、48和72 h，然后进行LRIG3、EGFR mRNA和蛋白表达的检测，同时检测细胞增殖率。设常规培养的细胞作空白对照。

1.4细胞增殖率的测定收集各组对数生长期的细胞，经过胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，经细胞计数后接种在96孔板，每孔细胞数103～104，每组3个复孔。待细胞铺满孔底，采用MTT 法检测细胞增殖率。酶标仪检测波长为492 nm。细胞增殖率=(A实验组-A0)/A0，A0为实验开始时实验组的A值。

1.5LRIG3和EGFRmRNA的检测根据PubMed检索设计合成LRIG3、EGFR以及内参GAPDH引物序列，由上海生工生物技术服务有限公司合成。LRIG3引物序列：正义链 5’-CACATCAATG GAACCTGGGTATTTTGAC-3’，反义链5’-GTTTCGGT TCAATTCGAGATGTTGCAGTT-3’，产物长度139 bp。EGFR 引物序列：正义链5’-TCCCTCAGCCAC CCATATGTAC-3’，反义链5’-GTCTCGGGCCATTTTG GAGAATCC-3’，产物长度125 bp。GAPDH引物序列：正义链5’-ACCACAGTCCATGAAATCAC-3’，反义链5’-AGGTTTCTCCAGGCGGCATG-3’，产物长度230 bp。用TRN-zol-A+RNA提取试剂盒抽提细胞总RNA，用 M-MLV 逆转录酶进行逆转录，取逆转录产物进行PCR。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，33个循环；最后72 ℃延伸7 min。产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，用Gel-Doc2000 型凝胶成像分析系统进行分析，以目的条带与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的基因mRNA的表达水平。实验重复3次。

1.6LRIG3和EGFR蛋白的检测采用Western blot法。用PMSF细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白，测定蛋白浓度，用100 g/L分离胶、50 g/L浓缩胶进行蛋白电泳，将蛋白转移到PVDF膜中，用含有50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭2 h，加一抗4 ℃过夜，用TPST洗膜3次，后加HRP标记的二抗孵育1 h，用TBST洗膜3次，DAB 显色，用图像分析系统检测条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 13.0进行统计分析。各组LRIG3、EGFR蛋白及mRNA表达水平及细胞增殖率的比较采用单因素方差分析及SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组细胞增殖率的变化见表1～3。转染LRIG3 ASODN后，细胞增殖率较空白对照组、SODN组、MSODN组明显增高。转染24、48、72 h后,3个ASODN剂量组间细胞增殖率差异有统计学意义(F=19.253、51.598、29.328,P=0.003、<0.001、<0.001),随着ASODN剂量的增加，细胞增殖率亦增高(P<0.05)。

表1 150mg/LLRIG3SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞增殖率的影响

组别n24h48h72h空白对照组30．645±0．0570．670±0．0500．673±0．085SODN组30．655±0．0970．709±0．0700．824±0．090MSODN组30．607±0．0760．705±0．0640．839±0．113ASODN组30．893±0．119∗3．015±0．286∗4．895±0．527∗F5．8884．31515．837P0．0200．0440．001

*:与其他3组比较，P<0.05。

表2 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞增殖率的影响

*:与其他3组比较，P<0.05。

表3 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞增殖率的影响

*:与其他3组比较，P<0.05。

2.2各组细胞中LRIG3和EGFRmRNA的表达

见图1及表4～6。ASODN组细胞中LRIG3 mRNA表达较其他3组明显下降，EGFR mRNA表达增高。转染24、48、72 h,3个ASODN剂量组间LRIG3和EGFR mRNA表达水平差异有统计学意义(F=17.043和9.974、47.514和15.066、85.374和11.650,P均<0.05),随着ASODN剂量的增加，LRIG3 mRNA表达水平降低(P<0.05)，EGFR mRNA表达水平升高(P<0.05)。

图1 转染24 h细胞中LRIG3(上)和EGFR(下) mRNA的表达

M：Marker；1～3：150、200、250 mg/L ASODN组；4：150 mg/L SODN组；5：150 mg/L MSODN组；6：空白对照组。

表4 150 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞中LRIG3和EGFR mRNA表达的影响

*:与其他3组比较，P<0.05。

表5 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞中LRIG3和EGFR mRNA表达的影响

*:与其他3组比较，P<0.05。

表6 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞中LRIG3和EGFR mRNA表达的影响

*:与其他3组比较，P<0.05。

2.3各组细胞中LRIG3和EGFR蛋白的表达见图2及表7～9。ASODN组细胞中LRIG3蛋白表达较空白对照组、SODN组、MSODN组明显下降，EGFR蛋白表达增高。转染24、48、72 h,3个ASODN剂量组间LRIG3和EGFR蛋白表达水平差异有统计学意义(F=12.325和4.287、25.185和10.941、16.046和9.951,P均<0.05),ASODN剂量越大，LRIG3蛋白表达水平越低(P<0.05)，EGFR蛋白表达水平越高(P<0.05)。

图2 转染48 h 细胞中LRIG3和EGFR蛋白的表达

M：Marker；1～3：150、200、250 mg/L ASODN组；4：150 mg/L SODN组；5：150 mg/L MSODN组；6：空白对照组。

表7 150 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞中LRIG3和EGFR蛋白表达的影响

*:与其他3组比较，P<0.05。

表8 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞中LRIG3和EGFR蛋白表达的影响

*:与其他3组比较，P<0.05。

表9 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN对Hela229细胞中LRIG3和EGFR蛋白表达的影响

*:与其他3组比较，P<0.05。

3 讨论

研究显示，LRIGs的异常表达和人类的许多疾病有一定的关系，在许多人类的肿瘤组织中都能检测到LRIGs的异常表达，但在不同肿瘤中LRIGs的表达存在很大差异，在结肠癌细胞系、前列腺癌细胞系、透明细胞癌组织、肺癌细胞系、皮肤鳞癌患者切除组织等多种组织细胞内LRIG1 mRNA和蛋白表达均较正常组织下降[7-8]，而在白血病、星状细胞瘤、前列腺癌中LRIG1的表达增高[9-10]。有关LRIG3与肿瘤的研究资料更为稀缺。

EGFR作为一种受体酪氨酸激酶，是Ⅰ型受体酪氨酸激酶超家族的成员，是原癌基因c-erbB1(HER-1)的表达产物，其在多数上皮来源性恶性肿瘤中过度表达，且表达水平与肿瘤的浸润、转移、恶性程度、预后、患者生存率密切相关[11]。EGFR蛋白的过表达能够使肿瘤细胞处于长期活化状态，从而导致细胞恶性增殖。

作者将LRIG3 ASODN转染宫颈鳞癌Hela229细胞，采用RT-PCR和Western blot法检测其LRIG3、EGFR mRNA和蛋白的表达。结果显示，LRIG3 ASODN能够显著抑制细胞中LRIG3 mRNA和蛋白的表达，且该效应具有一定的剂量依赖性；随着LRIG3表达的降低，细胞的增殖活性亦升高，细胞中EGFR mRNA和蛋白的表达也逐渐增强。提示LRIG3有可能通过调控EGFR的表达，从而抑制宫颈鳞癌细胞的增殖。

综上所述，LRIG3或许能成为辅助宫颈鳞癌诊断新的参考指标，同时对LRIG3的表达水平进行干预，提高其表达水平，可能成为宫颈癌分子靶向治疗的一个新的途径。

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(2013-12-10收稿 责任编辑王 曼)

Effect of LRIG3-targeted antisense oligonucleotides on proliferation and expressions of LRIG3 and EGFR in Hela229 cells

GUOLichen1,2),SHIHuirong1),SHENGYulan2),ZHANGPing’an2),ZHANGRui2)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofGynecologyandObstetrics,CentralHospitalofShanghaiJiadingDistrict,Shanghai201800

LRIG3;antisense oligonucleotide;EGFR;proliferation;cervical carcinoma

Aim: To observe the proliferation and expressions of LRIG3 and EGFR in Hela229 cells transfected with LRIG3-targeted antisense oligonucleotide(ASODN).Methods:The ASODN, SODN and MSODN of LRIG3 at doses of 150, 200 and 250 mg/L were transfected into Hela229 cells by the cationic liposome respectively for 24, 48, and 72 h. RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of LRIG3 and EGFR,and MTT assay was used to examine the proliferation of Hela229 cells. The cells with normal incubation were the blank control. Results: Compared with the blank control group, SODN group and MSODN group, the proliferation rate of ASODN group was significantly higher(P<0.05), the expressions of LRIG3 mRNA and protein decreased(P<0.05), and the expressions of EGFR mRNA and protein increased with the increase of ASODN concentration(P<0.05).Conclusion: LRIG3 ASODN can promote the proliferation of Hela229 cells, which is related to inhibition of LRIG3 expression and promotion of EGFR expression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.009

R737.33