补肾祛瘀化痰法对载脂蛋白E基因敲除小鼠认知功能的影响

姜 洋 杨惠民 占程燕 李 璐

(北京中医药大学第一临床医学院脑病三科，北京 100700)

补肾祛瘀化痰法对载脂蛋白E基因敲除小鼠认知功能的影响

姜 洋 杨惠民△占程燕 李 璐

(北京中医药大学第一临床医学院脑病三科，北京 100700)

目的通过研究补肾祛瘀化痰法对载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠认知功能的影响，探讨其组方通脉益智胶囊对认知障碍的疗效。方法将32只ApoE基因敲除小鼠随机分为4组，即成年中药组、老年中药组、成年模型组及老年模型组，每组8只；将16只相同遗传背景C57BL/6J小鼠随机分为2组，即成年正常组及老年正常组，每组8只。成年组小鼠至24周起、老年组小鼠至32周起，中药组以通脉益智胶囊灌胃12周，模型组与正常组以同容积0.9%氯化钠注射液灌胃12周，均每日1次。24周及36周时，成年组小鼠予跳台及避暗实验；32周及44周时，老年组小鼠予跳台及避暗实验。结果在24周给药前，成年中药组、成年模型组与成年正常组小鼠的错误次数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。记忆成绩显示，成年中药组、成年模型组与成年正常组小鼠的错误次数均较第1 d有所减少，但比较差异无统计学意义(P>0.05)；成年中药组、成年模型组与成年正常组小鼠的潜伏时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。表明在小鼠24周龄时未出现明显认知障碍。在给药12周后，成年中药组、成年正常组错误次数均较成年模型组降低(P<0.05，P<0.01)，成年中药组、成年正常组错误次数比较差异无统计学意义(P>0.05)。记忆成绩显示，成年中药组、成年正常组错误次数均较成年模型组降低(P<0.05，P<0.01)，潜伏时间均较成年模型组增加(P<0.05，P<0.01)；成年中药组、成年正常组错误次数、潜伏时间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。表明在小鼠36周龄后已出现认知障碍，补肾祛痰化瘀法对认知障碍有一定改善。在32周给药前，老年中药组、老年模型组小鼠的错误次数均较老年正常组多(P<0.05)，老年中药组与老年模型组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。第2 d的记忆成绩显示，老年中药组、老年模型组小鼠的错误次数均较老年正常组多(P<0.05)，潜伏时间均较老年正常组减少(P<0.05)，老年中药组小鼠的错误次数、潜伏时间与老年模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。表明32周龄时ApoE基因敲除小鼠已出现认知障碍。在给药12周后(第44周)，老年中药组、老年正常组的错误次数均老年模型组减少(P<0.05，P<0.01)，老年中药组的错误次数与老年正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。记忆成绩显示，老年中药组、老年模型组、老年正常组小鼠的错误次数均较前1 d有所减少，但比较差异均无统计学意义(P>0.05)；老年中药组、老年正常组的错误次数均较老年模型组减少(P<0.01)，潜伏时间均增加(P<0.01)；老年中药组的错误次数、潜伏时间与老年正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。表明在 44周龄时ApoE基因敲除小鼠已出现明显的认知障碍，而补肾祛瘀化痰法则对认知障碍有明显的改善作用。结论老年ApoE基因敲除小鼠存在认知功能损害；补肾祛瘀化痰法干预老年ApoE基因敲除小鼠后可改善行为学表现，进而改善认知功能。

小鼠，基因敲除；认知障碍，心理学；小鼠，转基因

阿尔兹海默病(alzheimer's disease，AD)严重影响老年人的生活质量，并给家庭和社会带来沉重负担，随着AD发病率逐年上升，寻求延缓或治疗的方法被医学界广泛关注。一些研究证实脂质代谢障碍可能参与AD的发病机制[1-2]。载脂蛋白E(ApoE)在脂质代谢过程中发挥了重要作用，其参与维护胆固醇、磷脂的动态平衡，调节神经膜重塑时胆固醇与磷脂的动员与再分布，维护和修复神经元。近年来，ApoE基因成为AD的重要危险因素。ApoE基因敲除小鼠被广泛应用于心脑血管疾病的动物模型，其因缺乏ApoE基因而出现脂质代谢障碍。有研究表明ApoE基因敲除小鼠在认知功能方面存在异常[3]。本实验通过观察补肾祛瘀化痰法对ApoE基因敲除小鼠认知功能的影响，为通脉益智胶囊治疗血管性痴呆及动脉粥样硬化的前期研究提供实验基础，为中医治疗认知功能障碍提供新的依据和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级8周龄ApoE基因敲除小鼠32只，均为雄性，体质量(20±2) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2011-0012；8周龄相同遗传背景C57BL/6J小鼠16只，均为雄性，体质量(20±2) g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK(军)2007-004。饲养场地为北京中医药大学清洁级实验动物房，普通饮食，充足摄食及饮水，室温(25±2) ℃，风力0级，每日光照12 h，湿度25%～35%。

1.1.2 实验药物 通脉益智胶囊。药物组成：女贞子、何首乌、丹参、赤芍药、石菖蒲、远志、漏芦。将上述药物水煎煮后浓缩干燥，粉碎过筛，混匀制成胶囊，由中日友好医院试剂科提供，京药制字Z20053786。

1.1.3 主要实验仪器 YLS-17B 避暗穿梭测试仪、2H-100型跳台试验箱，均由北京中医药大学基础医学院提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将32只ApoE基因敲除小鼠随机分为4组，即成年中药组、老年中药组、成年模型组及老年模型组，每组8只；将16只相同遗传背景C57BL/6J小鼠随机分为2组，即成年正常组及老年正常组，每组8只。

1.2.2 给药方法 成年组小鼠至24周起、老年组小鼠至32周起，中药组以通脉益智胶囊750 mg/(kg·d)(剂量根据人与实验动物用药剂量换算得出)灌胃12周，模型组与正常组以同容积0.9%氯化钠注射液灌胃12周，均每日1次。

1.2.3 实验方法 24周及36周时，成年组小鼠予跳台实验及避暗实验；32周及44周时，老年组小鼠予跳台实验及避暗实验。

1.2.3.1 跳台实验 第1 d让小鼠在箱内平台上适应3 min，然后通电，记录5 min内小鼠受到电击的次数，即错误次数；第2 d重新测试，记录5 min内小鼠第1次跳下平台的时间(即潜伏期)、5 min内小鼠受到的电击的总次数，5 min内小鼠未跳下平台其潜伏期按300 s计算。

1.2.3.2 避暗实验 本实验利用小鼠喜暗厌明的习性，第1 d训练前将小鼠头背着洞口放入明室，先适应环境3 min，然后给暗室铜栅通以36 V电流，小鼠一进入暗室即受电击，其正确反应是回到明室，铜栅通电持续5 min，此为训练过程。第2 d对小鼠进行记忆测验，记录小鼠第1次进入暗室的时间(即避暗潜伏期)，并记录5 min内小鼠进入暗室的次数(即避暗错误次数)，5 min内未进入暗室的小鼠其潜伏期按300 s计算。

2 结 果

2.1 成年组小鼠给药前跳台实验及避暗实验成绩比较 见表1。

表1 成年组小鼠给药前跳台实验及避暗实验成绩比较 ±s

由表1可见，在24周给药前分别进行跳台实验及避暗实验，第1 d为学习阶段，第2 d重复测试为记忆阶段。跳台实验和避暗实验的学习成绩显示，成年中药组、成年模型组与成年正常组小鼠的错误次数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。记忆成绩显示，成年中药组、成年模型组与成年正常组小鼠的错误次数均较第1 d有所减少，但比较差异无统计学意义(P>0.05)；成年中药组、成年模型组与成年正常组小鼠的潜伏时间均较第1 d降低，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。表明在小鼠24周龄时未出现明显认知障碍。

2.2 成年组小鼠给药后跳台实验及避暗实验成绩比较 见表2。

表2 成年组小鼠给药后跳台实验及避暗实验成绩比较 ±s

与成年模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表2可见，在给药12周后再进行跳台实验及避暗实验，学习成绩显示，成年中药组、成年正常组错误次数均较成年模型组降低(P<0.05，P<0.01)，成年中药组、成年正常组错误次数比较差异无统计学意义(P>0.05)。记忆成绩显示，成年中药组、成年正常组错误次数均较成年模型组降低(P<0.05，P<0.01)，潜伏时间均较成年模型组增加(P<0.05，P<0.01)；成年中药组、成年正常组错误次数、潜伏时间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。表明在小鼠36周龄后已出现认知障碍，补肾祛痰化瘀法对认知障碍有一定改善。

2.3 老年组小鼠给药前跳台实验及避暗实验成绩比较 见表3。

表3 老年组小鼠给药前跳台实验及避暗实验成绩比较 ±s

与老年正常组比较，*P<0.05

由表3可见，在32周给药前分别进行跳台实验及避暗实验，第1 d的学习成绩显示，老年中药组、老年模型组小鼠的错误次数均较老年正常组多(P<0.05)，老年中药组与老年模型组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。第2 d的记忆成绩显示，老年中药组、老年模型组小鼠的错误次数均较老年正常组多(P<0.05)，潜伏时间均较老年正常组减少(P<0.05)，老年中药组小鼠的错误次数、潜伏时间与老年模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。表明32周龄时ApoE基因敲除小鼠已出现认知障碍。

2.4 老年组小鼠给药后跳台实验及避暗实验成绩比较 见表4。

表4 老年组小鼠给药后跳台实验及避暗实验成绩比较 ±s

与老年模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表4可见，在给药12周后(第44周)再进行跳台实验及避暗实验，学习成绩显示，老年中药组、老年正常组的错误次数均老年模型组减少(P<0.05，P<0.01)，老年中药组的错误次数与老年正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。记忆成绩显示，老年中药组、老年模型组、老年正常组小鼠的错误次数均较前1 d有所减少，但比较差异均无统计学意义(P>0.05)；老年中药组、老年正常组的错误次数均较老年模型组减少(P<0.01)，潜伏时间均增加(P<0.01)；老年中药组的错误次数、潜伏时间与老年正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。表明在 44周龄时ApoE基因敲除小鼠已出现明显的认知障碍，而补肾祛瘀化瘀法则对认知障碍有明显的改善作用。

3 讨 论

中医学认为，AD属痴呆范畴，其病位在心和脑，属虚实夹杂之证，病机主要有肾精亏虚、髓海失充而导致脑失所养，或由肝郁脾湿、痰阻血瘀造成脑脉痹阻。治以补肾填精、益智开窍、涤痰化瘀为大法，佐以益气健脾、养血柔肝、通络开痹之品。通脉益智胶囊中女贞子、何首乌补肝益肾，填精充髓，有滋阴强壮之力，为君药；丹参、赤芍药活血化瘀，为臣药；石菖蒲、远志芳香化浊，祛痰利窍，为佐药；使以漏芦清热通窍疏经。诸药合用，共奏补肝益肾、化瘀祛痰、益智醒神之功。

ApoE基因在中枢神经系统中由星形胶质细胞合成并分泌，可调节神经膜重塑时胆固醇与磷脂的动员与再分布，维护和修复神经元。有研究发现[4]，ApoE基因可能与记忆呈相关性。ApoE基因敲除小鼠的血脑屏障的通透性是普通小鼠的3.7倍，这就导致一些非必需小分子化合物进入大脑，造成大脑功能的部分紊乱，从而可能引发老年痴呆[5]。贾雪梅等[6]发现，载脂蛋白E敲除小鼠海马神经元内β-淀粉样蛋白的表达高于C57BL/6J小鼠，与ApoE基因异常导致AD等神经退行性疾病的认知功能障碍可能有着密切联系。ApoE基因敲除小鼠一直被用于动脉粥样硬化的研究，由于其认知功能的异常，故近期亦被用于认知障碍的研究。

本实验中所采取的跳台实验及避暗实验均是检测结果比较明显的行为学实验，根据实验小鼠对电流刺激的记忆及学习能力来评价受试动物神经行为学在用药前后、组别之间的差异。由于跳台实验及避暗实验的操作性较强及灵敏度较高，故在各种小鼠的神经行为学检测中应用较广。本实验研究结果显示，在24周时，给药前各组并无明显异常，可能由于ApoE 基因敲除小鼠的认知功能损害在24周时并未出现，但当给药12周后，即成年组小鼠为36周龄时，认知功能损害已经显现，模型组小鼠在行为学表现方面明显差于中药组及正常组。而老年组ApoE基因敲除小鼠32周龄时在未给药的情况下，在跳台实验及避暗实验中的第1 d错误次数、第2 d错误次数及第2 d潜伏时间与正常组C57BL/6J小鼠比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，由此可推测32周龄的ApoE基因敲除小鼠比C57BL/6J小鼠的认知功能有所减低；给药12周至44周龄时，模型组与中药组、正常组在认知功能方面存在明显差异。老年中药组在给予通脉益智胶囊12周后进行跳台实验及避暗实验，在各个指标方面均优于同周龄模型组小鼠，并且与同周龄C57BL/6J小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)。结合成年组及老年组不同周龄小鼠的行为学表现可知，通脉益智胶囊针对认知障碍有效，而且在前期研究中，通脉益智胶囊针对血管性痴呆[7]、动脉粥样硬化[8]及高脂血症等均有较好疗效。

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(本文编辑：习 沙)

EffectsoftheprescriptionfortonifyingkidneyandremovingstasisandreducingphlegmoncognitivefunctionofApoEknockoutmice

JIANGYang，YANGHuimin，ZHANChengyan，etal.

EncephalopathyDepartmentThree，FirstClinicalCollegeAffiliatedtoBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100070

ObjectiveTo explore the effects of the prescription (Tongmai Yizhi capsule) for tonifying kidney and removing stasis and reducing phlegm on cognitive function of ApoE knockout mice.Methods32 ApoE knockout mice were randomly divided into four groups，the treatment group and model group of senior and the treatment group and model group of elder，8 mice in each group.And 16 C57BL/6J mice were divided into two groups as the normal groups in senior and elder 8 mice in each group.Mice in treatment group of senior

Tongmai Yizhi capsule from 24 weeks of mice for 12 weeks.Mice in treatment group of elder received Tongmai Yizhi capsule from 32 weeks of mice for 12 weeks.Mice in model group and the normal group received the same volume of 0.9% sodium chloride injection for 12 weeks.At 24 weeks and 36 weeks，jumping and to avoid dark experiment of mice in group of senior were finished.At 32 weeks and 44 weeks，jumping and to avoid dark experiment of mice in group of elder were finished.ResultsThere was no difference between the treatment group，model group and normal group in senior on the number of errors before treatment (P<0.05).After continuous infusion 12 weeks，there were differences between the treatment group，model group and normal group in senior on the number of errors in memory performance (P<0.05，P<0.01).The the number of errors in memory performance in the treatment group and normal group in senior were lower than that in model group in senior.Latent time was increased as compared with that in model group (P<0.05，P<0.01).There was no difference between treatment group and normal group on the the number of errors and latent time (P>0.05).The results showed that ApoE knockout mice at 36-weeks had cognitive impairment.The method of tonifying kidney and removing stasis and reducing phlegm can improve cognitive impairment.Before 32-weeks the number of errors in model group and treatment group in elder were more than that in normal group in elder (P<0.05).There was no difference between model group and treatment group in elder on the number of errors (P>0.05).After continuous infusion 12 weeks， The number of errors in memory performance in the treatment group and normal group in elder were lower than that in model group in senior (P<0.05).Latent time was increased as compared with that in model group (P<0.05，P<0.01).The results showed that ApoE knockout mice at 44-weeks had cognitive impairment.The method of tonifying kidney and removing stasis and reducing phlegm can improve cognitive impairment.ConclusionApoE knockout mice have cognitive impairment when they get old.The method of tonifying kidney and removing stasis and reducing phlegm can improve neurobehavioral manifestation and cognitive impairment on ApoE knockout mice.

Mice，Gene knockout；Cognitive disorders；Psychology；Transgenosis

△ 通讯作者：北京中医药大学第一临床医学院脑病三科，北京 100700

姜洋(1986—)，女，博士研究生在读，硕士。研究方向：老年病及神经内科学。

R245.97；R341；R395；R741

A

1002-2619(2014)03-0428-05

2013-07-03)