阿莫西林对副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的药敏试验
2014-08-30曹传家王春梅
曹传家+王春梅
摘要：以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株，采用阿莫西林对5株猪胸膜肺炎放线杆菌和6株副猪嗜血杆菌进行药敏试验，测定其最小抑菌浓度（MIC）。结果表明，胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌对阿莫西林敏感。
关键词：阿莫西林；猪胸膜肺炎放线杆菌；副猪嗜血杆菌；药敏试验
中图分类号：S852.61+2 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）06-0009-02
副猪嗜血杆菌（Hps）在环境中普遍存在，世界各地都有，甚至是健康的猪群当中也能发现。临床上以体温升高、关节肿胀、呼吸困难、多发性浆膜炎、关节炎和高死亡率为特征的传染病，严重危害仔猪和青年猪的健康。猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）可以感染从断奶到屠宰的各日龄的猪，但通常发生在8～16周龄，潜伏期短，可能只有12 h。病菌产生的毒素会导致肺部严重损伤[1]。猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的猪的一种高度致死性呼吸道传染病。从20世纪90 年代开始，随着集约化养猪业的迅速发展，加上国家及地区间引种工作的日益频繁，猪传染性胸膜肺炎在我国已广泛流行，并有扩大蔓延之势[2，3]。为对防治这两种细菌引起的疾病提供更好的用药方案，特对Hps和APP进行阿莫西林的药敏试验。
试验结果表明，APP和Hps对青霉素、卡那霉素、氯霉素、先锋霉素、强力霉素、阿莫西林、复方新诺明、沙星类药物、多粘菌素、利福平、喹诺酮和头孢噻呋类药物敏感。对于有APP和Hps潜在感染可能的猪场，平时在饲料中可以添加适量抗生素进行预防。一旦发现有APP和Hps感染，猪场应及时选用氯霉素、青霄素、新霉素、卡那霉素、增效磺胺类、呋喃类药物对感染动物进行治疗。长期使用同种抗生素易诱导细菌产生耐药性，并且APP和Hps耐药性现象已经广泛存在。因此，为了获得良好的预防治疗效果，并尽量避免耐药性产生，就需要进行药敏试验，筛选出低耐药性的药物。阿莫西林抗菌谱广，杀菌力强，在临床上用于治疗敏感细菌所致的各种感染，对于猪巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、嗜血杆菌、链球菌、葡萄球菌性呼吸道感染均有较好的效果[4]。为了更好的防治Hps和APP引起的疾病，本研究选择阿莫西林对这两种细菌进行药敏试验[5]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品和试剂 阿莫西林对照品（中国兽医药品监察所，K0220705），磷酸氢二钾（国药集团化学试剂有限公司，F20070423），磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司，F20070215），MH肉汤、TSA和TSB均由青岛海博生物技术有限公司生产。
1.1.2 主要仪器及设备 电子天平（湘仪天平仪器设备有限公司，TP320），分析天平（SHIMADZU），隔水式电热恒温培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），超净工作台（苏净集团安泰公司），手提式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂）。
1.1.3 试验菌株 大肠杆菌ATCC25922；App标准菌株7型（B7），3型（B3），1型（B1），地方分离菌株3型（D3），1型（D1）；Hps国际标准菌株S13，S5，S4，地方分离菌株13型（D13），5型（D5），4型（D4）。上述菌种均来自华中农业大学农业微生物学国家重点实验室。
1.2 方法
1.2.1 溶液配制
pH 6.0磷酸盐缓冲液：精密称取KH2PO4 8.0 g和K2HPO4 2.0 g，加蒸馏水溶解并稀释成1 000 mL，分装，121℃灭菌30 min备用。
阿莫西林标准储备液：将阿莫西林对照品置于37 ℃干燥箱干燥48 h后，精确称量14.78 mg于10 mL容量瓶中，用无菌pH 6.0磷酸盐缓冲液溶解并定容，得1 280 μg/mL阿莫西林储备液。-20 ℃保存。
1.2.2 培养基制备
胰酶大豆肉汤培养基：含TSB，30 g/L，121 ℃灭菌15 min，临用前加NAD（氧化型辅酶I）10 μg/mL和10%的无肺炎支原体犊牛血清。
胰酶大豆琼脂培养基：含TSA 40 g/L，121 ℃灭菌15 min，待温度降至50 ℃时，加入NAD 10 μg/mL和10%的无肺炎支原体犊牛血清。
MH肉汤培养基：21 g/L，115 ℃灭菌15min，校正pH7.4±0.2，121 ℃灭菌15 min，备用，临用前加NAD 10 μg/mL和10%的无肺炎支原体犊牛血清。
1.2.3 菌种复苏 将冻干菌种接种于含NAD与不含NAD的TSA平板上，37 ℃培养12 h。菌种在未含有NAD 的培养平板上不生长，而在含NAD的平板上生长。挑取在含NAD的培养平板上生长的单个菌落于NAD/TSA平板上进行纯培养，连续传代2次。
1.2.4 菌株接种 从TSA平板上选取传代3次之后的3～5个菌落，用接种环接触每个菌落顶部后将细菌转移到5mLTSB中。将此肉汤培养物置37℃孵育8h，用加有NAD和无肺炎支原体新生牛血清的MH肉汤将菌液稀释至相当于5号麦氏比浊管的浊度（浓度为1.5×108CFU/mL），将稀释后的菌液再稀释100倍备用。
1.2.5 最小抑菌浓度（MIC）测定 用微量稀释法测定最小抑菌浓度。将1 280μg/mL的药液用MH肉汤稀释至16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 μg/mL，微孔板以排为单位分为1、2、3、4、5、6、7、8组：每种菌做3个平行样。药液以从高到底的浓度加入到每行的第一孔至第十一孔中，每孔50 μL，再向第一孔至第十孔中各加入稀释好的菌液50 μL，第十一孔作为阴性对照孔，只加100 μL药液不加菌液，第十二孔作为阳性对照孔，只加100 μL菌液不加药物。放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。
2 结果与分析
培养24 h后，观察各孔细菌生长情况，与对照孔比较，以目测法找出始变澄清的第一孔，该管中所含药物浓度，即为MIC。
3 讨论
3.1 细菌的保存
由于App和Hps比较脆弱，在加入小牛血清和NAD的TSA培养基中4 ℃可存活7 d，在85%的甘油生理盐水中，-20 ℃下可存活3个月，存活时间均不够理想，所以在保这两种菌种时，笔者采用脱脂牛奶加TSB作为保护剂，对菌株进行真空冷冻干燥，并于-80 ℃中冰箱中保存，此方法保存的菌株，两年后仍能很好的进行复苏。
3.2 药物敏感性
由试验结果可知，所选的App和Hps对阿莫西林敏感，可以作为这两种细菌所引起疾病的治疗药物。由于本药敏试验使用的菌株比较少，无法进行MIC50和MIC90的计算，但有文献报道，在临床分离的App的药敏试验中，阿莫西林对App的MIC90分别为0.5 μg/mL[6]。要对感染App的猪进行有效治疗，阿莫西林在感染部位（肺部）的浓度需要达到
1 μg/mL。药动学试验表明，阿莫西林在给药后，血浆中的药物浓度通常为肺部的3倍，如果采用美国辉瑞公司生产的一种长效阿莫西林混悬注射液以15 mg/kg的剂量进行肌注给药，可以在App的感染部位达到足够的药物浓度。
参考文献：
[1] 陈 品.副猪嗜血杆菌耐药性分子机制研究[D].武汉：华中农业大学，2011.
[2] 陈小玲，杨旭夫，朱士盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施[J].中国兽医杂志，2001，7（37）：33-35.
[3] 高 林，宋良敏，金石等.猪传染性胸膜肺炎的诊断与防制[J].养猪，1999（1）：37-39.
[4] 张玲玲，江善祥.阿莫西林药理与毒理研究进展[J].兽药与饲料添加剂，2009，14（1）：20-23.
[5] 方泉明，黄建珍，黄冬艳.副猪嗜血杆菌江西株的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医，2009，36（4）：163-164.
[6] 曾振灵，丁焕中，杨志凌等.阿莫西林钠在猪体内的生物利用度及药动学研究[J].畜牧兽医学报，2002，33（6）：594-597.
2 结果与分析
培养24 h后，观察各孔细菌生长情况，与对照孔比较，以目测法找出始变澄清的第一孔，该管中所含药物浓度，即为MIC。
3 讨论
3.1 细菌的保存
由于App和Hps比较脆弱，在加入小牛血清和NAD的TSA培养基中4 ℃可存活7 d，在85%的甘油生理盐水中，-20 ℃下可存活3个月，存活时间均不够理想，所以在保这两种菌种时，笔者采用脱脂牛奶加TSB作为保护剂，对菌株进行真空冷冻干燥，并于-80 ℃中冰箱中保存，此方法保存的菌株，两年后仍能很好的进行复苏。
3.2 药物敏感性
由试验结果可知，所选的App和Hps对阿莫西林敏感，可以作为这两种细菌所引起疾病的治疗药物。由于本药敏试验使用的菌株比较少，无法进行MIC50和MIC90的计算，但有文献报道，在临床分离的App的药敏试验中，阿莫西林对App的MIC90分别为0.5 μg/mL[6]。要对感染App的猪进行有效治疗，阿莫西林在感染部位（肺部）的浓度需要达到
1 μg/mL。药动学试验表明，阿莫西林在给药后，血浆中的药物浓度通常为肺部的3倍，如果采用美国辉瑞公司生产的一种长效阿莫西林混悬注射液以15 mg/kg的剂量进行肌注给药，可以在App的感染部位达到足够的药物浓度。
参考文献：
[1] 陈 品.副猪嗜血杆菌耐药性分子机制研究[D].武汉：华中农业大学，2011.
[2] 陈小玲，杨旭夫，朱士盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施[J].中国兽医杂志，2001，7（37）：33-35.
[3] 高 林，宋良敏，金石等.猪传染性胸膜肺炎的诊断与防制[J].养猪，1999（1）：37-39.
[4] 张玲玲，江善祥.阿莫西林药理与毒理研究进展[J].兽药与饲料添加剂，2009，14（1）：20-23.
[5] 方泉明，黄建珍，黄冬艳.副猪嗜血杆菌江西株的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医，2009，36（4）：163-164.
[6] 曾振灵，丁焕中，杨志凌等.阿莫西林钠在猪体内的生物利用度及药动学研究[J].畜牧兽医学报，2002，33（6）：594-597.
2 结果与分析
培养24 h后，观察各孔细菌生长情况，与对照孔比较，以目测法找出始变澄清的第一孔，该管中所含药物浓度，即为MIC。
3 讨论
3.1 细菌的保存
由于App和Hps比较脆弱，在加入小牛血清和NAD的TSA培养基中4 ℃可存活7 d，在85%的甘油生理盐水中，-20 ℃下可存活3个月，存活时间均不够理想，所以在保这两种菌种时，笔者采用脱脂牛奶加TSB作为保护剂，对菌株进行真空冷冻干燥，并于-80 ℃中冰箱中保存，此方法保存的菌株，两年后仍能很好的进行复苏。
3.2 药物敏感性
由试验结果可知，所选的App和Hps对阿莫西林敏感，可以作为这两种细菌所引起疾病的治疗药物。由于本药敏试验使用的菌株比较少，无法进行MIC50和MIC90的计算，但有文献报道，在临床分离的App的药敏试验中，阿莫西林对App的MIC90分别为0.5 μg/mL[6]。要对感染App的猪进行有效治疗，阿莫西林在感染部位（肺部）的浓度需要达到
1 μg/mL。药动学试验表明，阿莫西林在给药后，血浆中的药物浓度通常为肺部的3倍，如果采用美国辉瑞公司生产的一种长效阿莫西林混悬注射液以15 mg/kg的剂量进行肌注给药，可以在App的感染部位达到足够的药物浓度。
参考文献：
[1] 陈 品.副猪嗜血杆菌耐药性分子机制研究[D].武汉：华中农业大学，2011.
[2] 陈小玲，杨旭夫，朱士盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施[J].中国兽医杂志，2001，7（37）：33-35.
[3] 高 林，宋良敏，金石等.猪传染性胸膜肺炎的诊断与防制[J].养猪，1999（1）：37-39.
[4] 张玲玲，江善祥.阿莫西林药理与毒理研究进展[J].兽药与饲料添加剂，2009，14（1）：20-23.
[5] 方泉明，黄建珍，黄冬艳.副猪嗜血杆菌江西株的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医，2009，36（4）：163-164.
[6] 曾振灵，丁焕中，杨志凌等.阿莫西林钠在猪体内的生物利用度及药动学研究[J].畜牧兽医学报，2002，33（6）：594-597.
