非小细胞肺癌组织中EML4-ALK融合基因与TYMS mRNA表达的关系
2014-08-30田玉旺许春伟高文斌张玉萍亓岽东
田玉旺 许春伟 高文斌 张玉萍 李 扬 亓岽东
在全球范围内，肺癌已跃居为发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1-2]。肺癌中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占80～85%[3]。EML4-ALK是2007年发现的由棘皮动物微管相关蛋白 4(echinoderm microtubule associated protein-like 4,EML4)与渐变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因融合而成的肺癌特异性融合基因，其在肺癌患者中的阳性率约为3%～8%[4]。EML4-ALK融合基因阳性具有与EGFR基因突变互斥性。NSCLC患者中最常见的EML4-ALK融合基因变异体是变异体1、2和3。变异体1的阳性率约为33%，变异体3的阳性率约为29%，变异体2的阳性率约为9%，这3种变异体占所有变异体的大多数，其他的多种变异体所占比例均较低[5-11]。
胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TYMS)编码的酶是dTMP从头合成的限速酶，在DNA合成、复制和修复中起着极其重要的作用[12]，它可导致DNA断裂并使细胞死亡，成为目前部分抗肿瘤药物重要的有效靶点。研究表明多种恶性肿瘤组织TYMS活性显著高于正常组织[13]。通过调节p53表达影响周期从而影响肿瘤细胞的增殖，TYMS与肿瘤增殖状态相关[14-15]，TYMS过表达的肿瘤细胞群具有生长优势潜能，提示TYMS高表达和不良预后呈负相关。
肺癌患者TYMS低表达时，其对一线化疗药培美曲塞(pemetrexed,ALIMTA)的有效性提高[16-17]。本研究通过多中心研究回顾257例Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者中EML4-ALK融合基因与TYMS mRNA表达情况并对其相互其关系进行分析，旨在了解NSCLC患者EML4-ALK融合基因与组织中这种耐药基因表达情况的关系，为进一步探索EML4-ALK融合基因患者更有效的个体化治疗方案。
材料与方法
一、实验材料
1. 资料来源：收集解放军北京军区总医院、大连大学附属中山医院、山东省潍坊市人民医院2004年至2013年间进行手术，术后病理诊断为肺腺癌且术前未经化疗、放疗及生物免疫治疗的组织蜡块标本257例(其中解放军北京军区总医院103例，大连大学附属中山医院58例，山东省潍坊市人民医院96例)，进行EML4-ALK融合基因和TYMS mRNA检测。
2. 主要试剂和仪器：DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，RNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，EML4-ALK基因表达检测试剂盒(福建厦门艾德有限公司)，肿瘤相关基因表达量相对定量检测试剂盒(TYMS，福建厦门艾德有限公司)，核酸蛋白质浓度测量仪B-500(上海创萌生物科技有限公司)，Mx3000P实时荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司)。
二、研究方法
1. 实时荧光定量PCR检测EML4-ALK融合基因：取4 μm厚度的石蜡组织切片4～8片，脱蜡；按照提取基因组RNA试剂盒(德国QIAGEN公司)说明书提供的方法提取组织RNA，应用分光光度计检测所提取RNA 的纯度和浓度。按照EML4-ALK基因表达检测试剂盒(福建厦门艾德有限公司)说明书提供的方法，在ABI7500 实时荧光定量PCR仪(美国life tech公司)中进行扩增，该试剂盒包含扩增EML4-ALK基因9种融合突变的引物及探针。
2. 实时荧光定量PCR检测NSCLC组织中TYMS mRNA的表达：取4 μm厚度的石蜡组织切片4～8片，脱蜡；按照提取基因组RNA试剂盒(德国QIAGEN公司)说明书提供的方法提取组织RNA，应用分光光度计检测所提取RNA 的纯度和浓度。按照肿瘤相关基因表达检测试剂盒(TYMS，福建厦门艾德有限公司)说明书提供的方法，ABI7500 实时荧光定量PCR仪(美国life tech公司)中进行扩增。用绝对定量法，以β-actin为内参基因对TYMS基因mRNA表达进行检测。TYMS标准均值为4.21×10-3(福建厦门艾德有限公司)。
三、统计学方法
所有数据采用SPSS19.0统计软件，结果运用χ2及Fisher确切概率法，检验水准α=0.05，并设定P值为双侧分布，以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、EML4-ALK融合基因和TYMS mRNA表达与患者临床特征的关系，见表1、图1。
257例NSCLC组织中EML4-ALK融合基因阳性11例(4.28%)；不吸烟者中EML4-ALK融合基因阳性率7.0%，显著高于吸烟者(P=0.007)，但与患者的性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结是否转移及临床分期等临床特征无关。257例NSCLC组织中TYMS mRNA高表达者163例(63.42%)，低表达者94例(36.58%)；TYMS mRNA表达水平与患者的性别、年龄、吸烟情况、肿瘤大小、淋巴结是否转移及临床分期等临床特征无关。
表1 EML4-ALK融合基因与TYMS mRNA表达与患者临床特征间的关系
图1 TYMS低表达
二、EML4-ALK融合基因与TYMS mRNA表达水平间的关系，见表2。
11例EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者中，TYMS mRNA低表达者8例(72.73%)；246例EML4-ALK融合基因阴性的NSCLC患者中，TYMS mRNA低表达者86例(34.96%)，EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者倾向于TYMS mRNA低表达(72.73%vs. 34.96%，P<0.05)。
表2 NSCLC组织中EML4-ALK融合基因与TYMS mRNA表达水平间的关系
讨 论
EML4-ALK基因融合的选择性抑制剂克唑替尼(crizotinib，商品名：赛可瑞)在NSCLC患者的临床实验中，由于Ⅰ期、Ⅱ期的临床试验收到了较好的效果，且不良反应小，患者耐受性好，目前已进入Ⅲ期临床实验。但2010年，Choi等[18]报道了1例EML4-ALK阳性的NSCLC患者，在经过5个月克唑替尼治疗后产生继发耐药，并发现2种点突变，突变位点为(C1156Y和L1196M)。因此进一步探索克唑替尼原发或继发耐药对患者的个体化治疗方案显得非常具有实用价值和现实意义[19]。
本研究结果显示，Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者中EML4-ALK融合基因阳性率为4.28%(11/257)，在不吸烟患者中较高(P<0.05)，与国内至今已报道的四个研究中，EML4-ALK融合基因阳性率为6.40%(31/484)相比略微偏低[8,20-22]。本组NSCLC患者中，TYMS的高表达率为63.42%(163/257)，与Ganda等[23]研究结果基本一致，且TYMS表达水平均与患者的性别、年龄、吸烟情况、肿瘤大小、淋巴结转移情况和病理分期等临床特征无关。
本研究发现，NSCLC患者中，EML4-ALK融合基因与TYMS表达水平有关(P<0.05)，EML4-ALK融合基因阳性患者TYMS呈低表达者较多。化疗耐受是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一。短期应用培美曲塞化疗后，可能出现TYMS诱导，而导致TYMS过表达、催化活性升高，使肿瘤细胞耐药。TYMS高表达使增殖期细胞DNA合成修复能力增强，从而使肺癌细胞不易被化疗药物杀死导致耐药，TYMS低表达却不易形成对培美曲塞耐药，增加了化疗有效的机会。这可能是EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者对化疗有较高的反应率内在机制的一个理论依据。
本研究初步明确了NSCLC患者EML4-ALK融合基因阳性患者中TYMS倾向低表达，推测EML4-ALK融合基因阳性患者应用培美曲塞化疗有效率高，但其内在的分子机制尚需进一步研究。本研究组以对化疗药中的铂类和他滨类药物耐药基因与EML4-ALK融合基因相互关系进行研究，而此次仅对培美曲塞耐药基因与EML4-ALK融合基因相互关系进行了研究，并未对一线化疗药中的微管类药物耐药基因TUBB3进行研究。因此期待关于EML4-ALK融合基因与微管类耐药基因TUBB3的研究和进一步探索更有效的个体化治疗方案，特别是对EML4-ALK融合基因选择性抑制剂克唑替尼原发或继发耐药患者的个体化治疗方案的研究报道。
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