青蒿素类药对A549和Hela细胞体外抗肿瘤活性的研究*

★ 郑绍琴 宋健平 王琪 刘亚军 裴晶 叶俏波

(1.广州中医药大学科技产业园有限公司 广州510445；2.广州中医药大学 广州 510405；3.广州市医药职业学校 广州 511455)

青蒿素(artemisinin,ART)是我国研究人员1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，此后陆续开发出青蒿琥酯(Artesunate,ATS)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)、蒿甲醚(artemether)等多种青蒿素类药物。最初青蒿素为一种高效、低毒的抗疟药物，尤其是脑型疟和恶性疟有效。近来学者研究发现青蒿素具有抗肿瘤功效,对多种肿瘤具有抑制、杀伤作用[1-4]，有希望被开发成为新型的抗肿瘤植物药。本研究以非小细胞肺癌A549和宫颈癌Hela细胞为对象，采用四甲基二氮唑蓝(MTT)法检测ART、DHA及ATS的体外抑制活性，观察不同青蒿素类药对不同肿瘤细胞的抗肿瘤作用。

1 实验材料

1.1 药品与试剂 青蒿素(广州汉方现代中药研究有限公司，批号为100651)；双氢青蒿素(重庆华立武陵山制药有限公司，批号为C00320110704-2)；青蒿琥酯(重庆华立武陵山制药有限公司，批号为20080502)；5-氟尿嘧啶注射液(简称5-Fu，上海旭东海普药业有限公司生，生产批号：H31020593)；低糖DMEM、HEPES均购自美国GIBCO公司；小牛血清购自广州畜牧场(批号20100618)；L-谷氨酰铵和MTT均购自Sigma公司；其他相关产品为国产试剂。

1.2 肿瘤细胞 非小细胞肺癌A549和宫颈癌细胞Hela，引自美国ATCC，由广州中医药大学热带医学研究所病毒实验室冻存传代保管。

1.3 仪器 美国宝特ELX800型全自动酶标仪；全自动CO2孵箱(上海力申科学仪器有限公司，型号：HF90)；倒置显微镜(日本Olympus，型号CK40)；海尔生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司，型号：HR40-ⅡA2)；SW-CJ-TF超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

2 实验方法

2.1 细胞接种 A549和Hela细胞常规复苏后，待细胞生长至一定数量后，用0.25%胰酶消化1～5min，终止消化，并用含10%血清的DMEM培养基重悬细胞。计数后用完全培养基调整细胞浓度为5.0×105/mL，按0.1mL/孔接种于96孔细胞板上，37℃，5%CO2条件培养。

2.2 A549和Hela细胞生长曲线的绘制 按2.1方法接种细胞，于接种后每24h做一次MTT染色。每天取4个复孔细胞进行MTT染色，分别连续12天和9天。最后结果以细胞MTT染色OD490为纵坐标，实验时间为横坐标，绘制出A549和Hela细胞的生长曲线。

2.3 加药处理 待细胞贴壁培养1～2d后，吸掉原有培养基，将药物分别配制成一定浓度，并对半稀释，后一孔药物浓度是前一孔的一半，放入37℃，5%C02培养箱培养。

2.4 MTT法检测 将加入药物的培养板放入37℃，5%CO2培养箱孵育72h后，每孔加入20μg/mL MTT溶液，置于37℃，5%CO2培养箱中保温4h，小心吸掉孔中原有培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡后静置10min，待结晶充分溶解后，用酶标仪测定A490nm值，并计算抑制率(%)=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100。

2.5 半数抑制浓度(IC50)计算 将配好的药物用含10%的DMEM培养基稀释，青蒿素100μg/mL、青蒿琥酯100μg/mL、双氢青蒿素100μg/mL和5-Fu100μg/mL溶液，根据对半稀释方法加药，每个浓度设3个复孔，空白对照9个复孔，MTT法检测，计算出不同浓度药物的抑制率，将剂量与对应抑制率输入Shmm公司IC50.exel.o版本软件计算各药物的IC50。

2.6 药效结果判定 通过对A549和Hela细胞株的IC50值确定青蒿素类药物在体外对这两株肿瘤细胞的抑制活性。

3 实验结果

3.1 A549细胞和Hela细胞的生长曲线 通过测得OD值绘制A549和Hela细胞的生长曲线如图1和图2。

图1 A549细胞的动态生长曲线

图2 Hela细胞的动态生长曲线

由上图分析可示：这两款细胞生长大致经历延滞期、对数生长期、平台期、缓慢凋亡期、快速死亡期五期。细胞从培养24h开始进入对数生长期，24h到96h基本处于稳定的平台期，96h之后经历一个缓慢凋亡期，A549第4d达到顶峰，Hela细胞第5d达到顶峰，然后迅速进入快速死亡期。所以我们选择细胞生长72h为干预点对细胞进行干预研究。

3.2 青蒿素类药物对A549和Hela细胞的抑制活性 根据MTT法测得的OD值计算得到各类药物对肿瘤细胞的增殖抑制率见表1；以细胞增殖抑制率输入Shmm公司IC50.exel.o版本软件计算得到青蒿素类药物对A549和Hela二株肿瘤细胞的抑制活性,见表2。

表1 青蒿素类药物对A549细胞和Hela细胞的抑制率±s)

表2 青蒿素类药物对A549细胞和Hela细胞的抑制活性/μg·mL-1

结果显示：青蒿素、双氢青蒿素及青蒿琥酯对二株肿瘤细胞有选择性的抑制作用，且呈量效关系，随着剂量的递减，青蒿素类药物对A549和Hela细胞的抑制率也逐渐下降。通过上表可以看出，双氢青蒿素和青蒿琥酯对二株肿瘤细胞均有较强的抑制作用，但青蒿素对A549细胞的抑制活性较弱。利用IC50软件测得青蒿素类药物对A549和Hela细胞72h的IC50分别为:A549细胞(ATS27.97μg/mL、DHA43.90μg/mL)和Hela细胞(ART48.10μg/mL、ATS34.60μg/mL、DHA15.94μg/mL)。

3.3 讨论 肿瘤是严重危害人类生命、健康的常见多发病。就全球而言，20世纪末的近20年间癌症的发病率一直呈上升趋势，其死亡率仅次于心血管病而位居第二[5]。对抗肿瘤药物的研究是当今的一个热点。在不断研制新药的同时,老药新用也是研究抗肿瘤药物的一个途径，青蒿素类药物近年来被广泛用于抗肿瘤药物的研究。经研究发现,青蒿素类药物的作用机制主要是通过内部的过氧化桥实现的。它还可以通过阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成、与Fe2+作用的细胞毒作用、抑制端粒酶活性、逆转多药耐药和增加化疗敏感性、调节肿瘤相关基因的表达以及损伤细胞线粒体等作用机制而实现抗肿瘤作用[6，7，8]。因此有必要进一步加强青蒿素类药物抗肿瘤的研究。

本实验室采用MTT法对青蒿素类药物的抗肿瘤活性进行了两株肿瘤细胞的系统性评价。从实验结果可以看出，青蒿素在体外仅对二株肿瘤细胞中的Hela细胞有抑制活性，对A549细胞抑制活性较弱；而青蒿琥酯和双氢青蒿素对二株肿瘤细胞均有抑制活性，且活性较好，但双氢青蒿素对Hela细胞的抑制活性与青蒿琥酯相比较强，而对A549细胞抑制活性青蒿琥酯强于双氢青蒿素。根据本实验室对青蒿素类药物体外抑制肿瘤活性研究的结果，青蒿琥酯和双氢青蒿素对肿瘤细胞的抑制作用较强，而青蒿素抑制作用较弱。根据青蒿素类药物对肿瘤细胞的选择性抑制作用，在进行深入研究时，可以进行有针对性的研究。青蒿素类药物抑制肿瘤细胞活性的差异性，提示我们这可能与化学药物的结构有关。双氢青蒿素为青蒿素经四氢酸钠还原所得，而青蒿琥酯的代谢产物是双氢青蒿素，各衍生物的极性不同，或许会导致细胞对其摄取或结合的程度也不相同，从而影响药物抗肿瘤活性。

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[7]于莎莎,佟丽斐,刘娜.青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用及其最新进展[J].中国实用医药,2009,4(12):234-235.

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