白附片含药血清对大鼠软骨细胞增殖影响的实验研究*

★ 许世兵 单乐天 金红婷 童培建 肖鲁伟

(1.浙江中医药大学 浙江 杭州 310053；2.浙江省中医院 浙江 杭州 310006)

膝关节骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是临床最常见的骨关节病之一，其特征性是进行性的软骨退变，病变发展至晚期最终将导致关节功能丧失，临床最终的治疗选择是关节假体置换。软骨细胞作为关节软骨中唯一一种细胞，其功能的异常是骨性关节炎变化的开始和关键[1]。软骨细胞凋亡的增加、合成和分解代谢平衡的破坏均可造成软骨细胞数量减少和软骨基质破坏，关节软骨细胞数量减少和软骨基质破坏，关节软骨性能和力学结构发生改变，从而导致骨性关节炎的发生[2]。为进一步明确其治疗关节炎的作用机制，本实验拟通过建立大鼠膝关节软骨细胞培养体系，观察中药白附片对软骨细胞增殖的影响，以探讨单味中药对骨性关节炎软骨退变的治疗作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gbico)、Ⅱ型胶原酶(Solarbio)、DMEM培养液(吉诺)、RPMI1640培养液(吉诺)、胎牛血清(FBS)、MTT(Solarbio)、DMSO(Sigma)

1.2 仪器 培养箱(Thermo)、洁净工作台(Airtech)、倒置相差显微镜(Olympus)、酶标仪(Bio-tek)、台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、微量振荡器(杭州亚美电子设备厂)、注射器针头滤器0.22um滤膜、培养板(NEST)、细胞计数板等。

1.3 药物及其来源 白附片由浙江中医药大学饮片厂。1月龄雄性SD大鼠20只，体重(105±10)g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(沪)-2008-0016。标准饲料喂养，自由饮水。

1.4 血清采制方法 大鼠所用生药剂量按照人与动物千克体重换算，白附片组按大鼠每千克体重用药10g的剂量进行换算灌胃；对照组灌服0.9%生理盐水，1次/d，连续7d，末次灌胃(末次灌胃前禁食不禁水12h)2h后，麻醉动物，心脏取血，静置2小时后，3000r/min离心20min分离血清，56℃灭活30min，抽滤除菌后，分装，-20℃低温冰箱保存备用。根据实验需要制备不同浓度的含药血清。

1.5 软骨细胞的分离与培养 大鼠按水合氯醛0.3mL/100g，腹腔注射，麻醉。无菌条件下取健康一月龄大鼠的膝关节，剪碎至1mm×1mm×1mm大小，加入0.25%胰蛋白酶，置振荡器上，37℃震荡消化30min，消化后离心(1500r/min，5min)去上清，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶在37℃振荡消化4h，每隔45min摇晃1次。将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用吸管吸出，220目尼龙网过滤，离心，获取软骨细胞，将消化所得的细胞悬浮于含10%胎牛血清，100μ/mL青霉素，100μg/m1链霉素的DMEM/F12培养基中，按密度为1×105cells/mL接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养(温度37℃，CO295%湿度)。48h后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每2d更换培养液1次。

1.6 软骨细胞的鉴定及形态学观察 采用文献报道[3]的甲苯胺蓝染色的方法，将制备好的第3代细胞爬片，PBS漂洗3次，40g/L多聚甲醛固定30min，PBS漂洗2次，1%甲苯胺蓝染色30min，自来水浸洗，无水乙醇迅速漂洗1次，干燥后中性树胶封固，镜下观察。

1.7 MTT法检测中药药理血清对软骨细胞增殖的影响 第3代软骨细胞消化后以3×104/mL浓度接种于96孔培养板中，细胞进入对数生长期后去培养液，分别加入不同浓度白附片含药血清(5%、10%、15%)每个浓度10个复孔；对照组予以空白血清干预，培养24，48，72h后分别加入MTT新鲜溶液(5mg/mL)，每孔20μL，细胞培养箱中继续孵育。4h后小心吸除上清，滴加150μL DMSO溶液，微量振荡器上震荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长测定各孔的吸光度(A)的值，读取吸光度值。

2 结果

2.1 软骨细胞的形态及鉴定 原代软骨细胞呈圆球形,悬浮状态，接种24h后可见大量的细胞贴壁，显微镜下圆形增大，伸张形成突起。早期细胞一般呈多角形，胞核为圆形或椭圆形，位于胞体中心，核仁为1～3个，致密程度和大小不等。胞体越大，核仁越清晰，胞核较稳定。培养4d，可见细胞成簇现象，保持圆形或椭圆形生长状态，且出现重叠生长现象。8d左右，细胞增殖逐渐融合形成单层，外观呈典型“铺路石”状。原代、第2代、第3代细胞生长良好，增殖、分化及分泌基质的能力强，细胞增殖速度快。第5代细胞体积开始变大，边缘出现一些指状突起，核也变大，胞膜和胞浆不清晰，增殖速度减慢，细胞呈纤维细胞样。甲苯鞍蓝染色能使酸性黏多糖异染成红紫色，染色后细胞内可见蓝紫色异染颗粒，周围有少量异染颗粒。见图1～2。

图1 软骨细胞显形态图(×100)

图2 软骨细胞甲苯胺蓝染色图(×100)

2.2 白附片含药血清对软骨细胞增殖的影响

表1 MTT比色法检测白附片含药血清对大鼠膝关节软骨细胞增殖(A)的影响

注：与空白组比较，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.01。

3 讨论

3.1 骨性关节炎的病机与祛风湿、止痹痛治法 中医基础理论认为，“肾主骨生髓”，肾虚则筋骨不荣。《素问·六腑脏象论篇》曰：“肾者……,其充在骨。”《素问·痹症》、《诸病源候论·风痹证》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹，其状肌肉顽厚或疼痛”。膝骨性关节炎属“骨痹”、“痛痹”范畴，乃风寒湿邪合入所致，是气滞血瘀、经络痹阻，本虚标实、虚实夹杂之证。其本是肾虚，标是风寒湿邪、痹阻经络，虚实夹杂之证则为肝肾亏损、血气不足，夹杂风寒湿邪痹阻经络；治本之法为补肾，治标之法有祛风散寒除湿、行气活血、舒经通络，治虚实夹杂证则以益气养血、滋补肝肾、辅以祛风除湿、化瘀通络[4]。根据上述治法选用复方中药对“骨痹”、“痛痹”证OA患者展开治疗，结果表明对证中药疗效显著。附子具有回阳救逆、补火助阳、补肾命火、逐风祛湿散寒止痛之功效，常用于寒湿痹痛等证[5]。附子虽有毒，但历来被医家称为药中之圣药、“回阳救逆第一品药”，用于急、危、重症，多能力挽狂澜；施于慢性顽病痼疾，亦能起沉疴于须臾。正因为附子的特有功效，从古至今，一直被广泛应用于临床。

3.2 MTT法检测软骨细胞增殖的原理 白附片对培养关节软骨细胞影响的研究选用了MTT法测细胞活性及增殖能力。其特点是灵敏度高,重复性好,操作简便,无放射性污染。MTT可被活细胞的线粒体内琥珀酸脱氢酶及内质网内的某些还原酶裂解成深蓝色的甲瓒结晶。甲瓒的形成量与活细胞数目成正相关。而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞的数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比,与其它检测细胞活力的方法有良好的相关性。

3.3 总结与展望 在本实验中，通过观察对空白组、含药血清组的比较，发现5%、10%、15%白附片含药血清可以促进软骨细胞代谢，促进实验性骨性关节炎软骨细胞增殖，对损伤的软骨有一定的修复功能，可能是白附片在临床上治疗骨性关节炎具有较好效果的部分机理，其具体作用机制有待进一步的研究，为临床疗效提供理论依据。

[1]Bryan J．Studies on donal cartilage strains II selective effects of different growth comditions[J]. Exp Cell Res,1988,52:327-337.

[2]Cruz M．Structural lesion and disability-not only rheumatoid arthritis but also osteoarthritis[J]. Acta Reumatol Port,2008,33(4)：475-476．

[3]尹宝英，张涌，张浩，等．蚕丝及II型胶原凝胶支架负载软骨细胞构建组织工程类软骨[J].上海交通大学学报(农业科学版),2008，26(4)：286-289.

[4]江蓉星,熊华,金桂花.骨性关节炎的临床治疗研究概况[J].中国中医骨伤科杂志,2003,11(1):57-58.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(第一部)[S].北京:化学工业出版社.2010:132.