金雀异黄素对氧化损伤的人晶状体上皮细胞凋亡的防护作用*

★ 林瑶 黄秀榕* 祁明信 黄露芬 郭娜 唐宋文 陈旭征

(1.福建中医药大学中西医结合学院 福建 福州 350108；2.福建中医药大学附属第二人民医院眼科 福建 福州 350003；3.福建中医药大学中西医结合研究院 福建 福州 350108)

老年性白内障，中医病名为圆翳内障，研究表明晶状体氧化损伤以及由氧化损伤诱导的晶状体上皮细胞凋亡是老年性白内障形成的主要机制[1,2]。有报道雌激素能够减轻晶状体氧化损伤程度，抑制晶状体上皮细胞凋亡，在白内障的发生发展过程中起一定的防护作用[3,4]。但是，长期使用雌激素替代疗法(Hormone Replacement Therapy，HRT)有引起子宫内膜癌、乳腺癌和阴道出血的风险。富含植物雌激素的植物，如大豆等具有类雌激素样活性，可以替代雌激素并防止雌激素不良反应的发生。

金雀异黄素(Genistein，Gen)是大豆中提取的有效单体，在化学结构上与雌二醇(β-Estradiol，E2)相似，具有微弱雌激素样作用，目前对其在抗肿瘤、治疗心血管疾病及防治骨质疏松等方面已进行了大量深入的研究[5-7]。然而金雀异黄素对氧化损伤所致的人晶状体上皮细胞(Human Lens Epithelia Cell，HLEC)的凋亡是否具有防护作用，有待研究。本研究拟在复制实验性HLEC氧化损伤模型的基础上，以E2为阳性对照，采用流式细胞仪(flow cytometer，FCM)检测HLEC凋亡率和线粒体膜电位(mitochondria membrane potential，ΔΨM)的变化，探讨植物雌激素Gen对氧化损伤的HLEC的防治作用，为寻求防治白内障的确切有效药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 流式细胞仪(美国BD FACS Calibur)、二氧化碳培养箱(美国FORMA 2111)、倒置相差显微镜(日本Olympus IMT-413)、超净工作台(江苏SW-CJ-IF)、微量移液器(法国GILSON)、冰箱(青岛BCD-268)、超低温冰箱(日本MDF-V5410)、微量电子天平(上海FA200X)、低速水平离心机(北京LD4-2)、恒温水浴锅(深圳HH-4)、干燥箱(上海101A-2)等。

1.2 主要试剂 金雀异黄素(Genistein, Gen)粉末，纯度98%，美国Sigma公司；E2(β-Estradiol,E2)粉末，纯度97%，美国Sigma公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，美国BD公司；线粒体膜电位检测(JC-1)试剂盒，碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)，美国Amresco公司；DMEM培养基(Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium)，美国Thermo scientific公司；胰蛋白酶(Trypsin)，美国Gibco公司；新生牛血清(Newborn Calf Serum，NCS)，奥地利PAA公司；磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，美国Thermo scientific公司；30%H2O2，上海试剂总厂。

1.3 HLEC复苏、培养及传代 采用永生化人晶状体上皮细胞B3系(HLEC-B3)进行实验。取出保存冻存细胞的冻存管立即放入37℃水中，将溶解的细胞悬液用10倍体积以上的培养液进行稀释，离心，除上清，反复洗涤3次。以5×105个/mL接种于培养瓶中，37℃ 5%CO2培养箱培养，待细胞生长融合后进行传代培养用于实验。

1.4 分组与给药 ①空白对照组：HLEC+DMEM培养液；②H2O2组：空白对照组+3×10-4mol/L H2O2；③E2组：H2O2组+1×10-8mol/L E2；④Gen组：H2O2组+1.85×10-5mol/L Gen。

1.5 FCM检测细胞凋亡率的变化 按上述分组将H2O2以及E2、Gen分别与HLEC共同孵育24h后，收集漂浮及贴壁的细胞，离心沉淀细胞；用预冷的PBS洗涤细胞两遍；取5×105个细胞，重悬于0.5mL Binding Buffer；加入5μl Annexin V-FITC和5μlPI，混匀，室温避光孵育15min，1小时内于流式细胞仪检测。

1.6 FCM检测HLEC内线粒体膜电位的变化 按上述分组将H2O2以及E2、Gen分别与HLEC共同孵育24h后，收集漂浮及贴壁的细胞，离心沉淀细胞；用预冷的PBS洗涤细胞两遍；取5×105个细胞，重悬于0.5mL细胞培养液中；加入0.5mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，细胞培养箱中37℃孵育20min；在孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液(5X)加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴；37℃孵育结束后，600g 4℃离心3～4min，沉淀细胞，弃上清；用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次：加入1mL JC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g 4℃离心3～4min，沉淀细胞，弃上清，共两次；再用适量JC-1染色缓冲液(1X)重悬后，于流式细胞仪检测分析。

2 结果

2.1 金雀异黄素对各组HLEC凋亡率的影响 采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率，FCM结果显示:H2O2组HLEC凋亡率显著高于空白对照组(P<0.01)；E2、Gen组的凋亡率显著低于H2O2组(P<0.01)。结果见表1。

表1 Gen对H2O2损伤的HLEC凋亡率的影响

注：与空白对照组比较，##P<0.01，与H2O2组比较，**P<0.01。

2.3 金雀异黄素对各组HLEC线粒体膜电位的影响 采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位(ΔΨM)，ΔψM正常细胞JC-1染色后呈红色荧光(R2区)，而ΔψM下降的细胞则出现红色荧光减弱和(或)绿色荧光增强(R3区)。FCM结果显示：H2O2组的R3区细胞，即ΔψM下降的细胞比例显著高于空白对照组，(P<0.01)；而E2和Gen组的R3区细胞比例显著低于H2O2组(P<0.01)。结果见表2、图1。

表2 Gen对H2O2损伤的HLEC线粒体膜电位的影响

注：与空白对照组比较，##P<0.01，与H2O2组比较，**P<0.01。

图1 Gen对H2O2损伤的HLEC线粒体膜电位的影响的流式图

3 讨论

本课题组前期研究已表明H2O2是一种活性氧，可诱导HLEC发生氧化损伤，并引起HLEC的凋亡[8,9]。流行病学和许多基础研究均提示雌激素对氧化损伤的HLEC的凋亡具有防护作用[3,4]，但长期使用雌激素副作用较多。植物雌激素，尤其是从豆类植物中提取的植物雌激素，可以替代雌激素的作用并同时降低雌激素不良反应的风险。前期研究表明植物雌激素可降低氧化损伤的HLEC的凋亡率、提高HLEC线粒体跨膜电位，从而减轻实验性氧化损伤的HLEC的凋亡程度[10,11]。

金雀异黄素(Gen)是从大豆中提取的一种植物雌激素。中医学认为，大豆性味甘平，具有健脾补中、润燥消水、排脓解毒、消肿止痛之功效。《延年秘录》中载：服食大豆可令人“长肌肤，益颜色，填骨髓，加气力，补虚能食”。金雀异黄素是大豆中最主要的活性成分，在化学结构上与雌二醇相似，能竞争性地结合雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)，具有雌激素样作用[12]。虽然其生物效应仅相当于雌二醇的10-5～10-3，但它在循环中的浓度能比内源性雌二醇高100倍[13]。因此Gen可应用于雌激素替代疗法，具有安全、廉价、来源广泛等优点。本课题组前期研究已证实Gen可提高H2O2损伤的HLEC内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性、降低膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量，对实验性HLEC的氧化损伤具有防护作用[14]。

本实验H2O2组线粒体膜电位较空白对照组显著降低，而E2和Gen组线粒体膜电位较H2O2组显著升高，说明H2O2可导致HLEC线粒体损伤，线粒体通透性增加，其膜电位下降；而E2和Gen可保护被H2O2损伤的HLEC的线粒体膜，升高其膜电位。同时本实验通过对各组凋亡率的检测发现，H2O2组凋亡率较空白对照组显著升高，而E2和Gen组凋亡率较H2O2组显著下降，提示金雀异黄素作为一种植物雌激素可能发挥了类雌激素的作用，通过升高H2O2损伤的HLEC的线粒体膜电位，提高了线粒体膜的稳定性，减轻了H2O2损伤引起的凋亡程度，对H2O2诱导的HLEC的凋亡具有防护作用。本实验结果为金雀异黄素防治老年性白内障提供了初步的实验依据。

[1]Zheng Y, Liu Y, Ge J, et al．Resveratrol protects human lens epithelial cells against H2O2-induced oxidative stress by increasing catalase, SOD-1, and HO-1 expression[J].Mol Vis,2010,16(4):1 467-1 474.

[2]Li WC，Kuszak JR，Dunn K，et a1．Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals[J].J Cell Biol，1995，130(1):169-181.

[3]Wang X，Simpkins JW，Dykens JA，et al. Oxidative damage to human lens epithelial cells in culture: estrogen protection of mitochondrial potential，ATP，and cell viability[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(5):2 067-2 075.

[4]Gottipati S，Cammarata P R. Mitochondrial super-oxide dismutase activation with 17 β-estradiol-treated human lens epithelial cells[J].Mol Vis，2008，14(16):898-905.

[5]Shim ES，LeeHH，Cho SY，et al. Genistein downregulates SREBP-1 regulated gene expression by inhibiting site-I protease expression in HepG2 cells[J].Nutr, 2007，137:1 127-1 131.

[6]刘莉，李鑫，刘丰.大豆异黄酮对代谢综合征模型大鼠血脂及肝脏PPARα基因的影响[J].中国现代医学杂志,2009,19(15):2 281-2 285.

[7]Ward H A，Kuhnle G G，Mulligan A A，et al. Breast，colorectal,and prostate cancer risk in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition-Norfolk in relation to phytoestrogen intake derived from an improved database[J].Am J Clin Nutr，2010，91(2):440-448.

[8]祁明信，黄秀榕，严京,等.菊花防护晶状体上皮细胞氧化损伤及信号转导机制的实验研究[J].福建中医学院学报，2008,18(6)：26-29.

[9]黄秀榕，祁明信，严京,等.细胞凋亡抑制剂防护晶状体上皮细胞氧化损伤及信号转导机制[J].光明中医，2008，23(10)：1 407-1 409.

[10]冯春燕，黄秀榕，祁明信,等.异补骨脂素对H2O2诱导氧化损伤的人晶状体上皮细胞NF-κB表达的影响[J].中华中医药杂志，2011，26(4)：835-837.

[11]黄秀榕，祁明信，郭娜,等.蜕皮甾酮对氧化损伤的人晶状体上皮细胞凋亡的防护作用[J].中华中医药学刊2010，28(4)：692-695.

[12]朱俊东，杨家驹.大豆异黄酮抗癌作用研究进展[J].国外医学·卫生学分册，1998，25(5)：257.

[13]迟晓星.植物雌激素及其对雄性生殖系统影响的研究进展[J].国外医学卫生学分册，2001,28(6)，346-348.

[14]林瑶，黄秀榕、祁明信,等.金雀异黄素对过氧化氢作用的人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响[J].福建中医药大学学报，2012，22(1)：26-27.