加减四君子汤胃内漂浮片的质量控制研究*

★ 楼婷婷 陈佳丽 袁强

(1.浙江中医药大学药学院 浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第二医院 浙江 杭州 310005)

加减四君子汤(JJSJZT)主要由人参、白术、茯苓、甘草、白芍、白花蛇舌草组成，临床主要用于治疗消化系统疾病，如慢性胃炎[1]、胃溃疡[2]、十二指肠球部溃疡[3]、胃窦炎、胃肠功能减退[4]等，加减四君子汤能一定程度抑制胃癌与癌前病变的发生[5]。本文根据各种药物的有效部位及成分性质分别采用相应工艺条件提取，使其在充分发挥保留有效成分及保证疗效的前提下提高了用药效率。已有的研究表明[6-8]，胃内漂浮片可延长药物在胃内的滞留时间，并持续均匀释放所载药物，延长药物释放时间，改善药物吸收，提高生物利用度，使疗效得到改善，故选择胃内漂浮片为本药剂型。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪；紫外可见分光光度计UV-2550(日本岛津公司)；KQ5200超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；十万分之一电子天平(德国塞多利斯)；R204型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；HH-2型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。

1.2 试药

1.2.1 试剂 乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为过0.2μm滤膜的纯水，甲醇、乙醇、正丁醇等其他试剂均为分析纯，购自华东化工仪器试剂有限公司。

1.2.2 对照品 人参皂苷Rb1对照品(中国药品生物制品检定所，含测用，批号：110704-200921)；人参皂苷Rg1对照品(中国药品生物制品检定所，含测用，批号：110703-200726)；人参皂苷Re对照品(中国药品生物制品检定所，含测用，批号：110754-200822)；芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，含测用，批号：110736-201035)；D-无水葡萄糖(中国药品生物制品检定所，含测用，批号：110833-200503)；人参对照药材(中国药品生物制品检定所，批号：120917-200609)。

1.2.3 试药 三批加减四君子汤胃内漂浮片(自制)；人参、白芍等药材均购自浙江中医药大学中药饮片厂，经浙江中医药大学药学院宋捷民教授鉴定合格。

2 方法[9-12]与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 人参的鉴别 取本品粉末5g，加甲醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加10mL水使溶解，用水饱和正丁醇萃取3次(15,10,10mL)，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。吸取人参皂苷Rg1、Re、Rb1溶液，对照药材溶液，药材溶液，供试品溶液，阴性对照溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(32∶11∶2)为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果见图1。

2.1.2 白芍的鉴别 取本品粉末5g，加乙醇50mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加10mL水使溶解，用水饱和正丁醇萃取3次(15,10,10mL)，合并萃取液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。吸取芍药苷溶液，白芍药材溶液，供试品溶液，阴性对照溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果见图2。

1.人参皂苷；2.人参对照药材；3. 人参药材；4.胃内漂浮片样品；5.阴性(缺人参药材)

1.芍药苷；2.白芍药材；3、4. 胃内漂浮片样品；5.阴性(缺白芍药材)

2.2 含量测定

2.2.1 HPLC法测定制剂中人参皂苷、芍药苷的含量

2.2.1.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18(4.6mm ×250mm，5μm)；检测波长：人参皂苷203nm，芍药苷230nm；柱温：人参皂苷30℃，芍药苷25℃；流速：均为1.0 mL/min；流动相：人参皂苷为(0～10 min，乙腈-水为19∶81；10～40min，19～29乙腈；40～45 min，29～31 乙腈；45～60min，31～37乙腈)、芍药苷为乙腈-水为14∶86；进样量：10 μL。

2.2.1.2 线性关系考察 分别精密吸取人参皂苷和芍药苷对照品溶液适量注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定人参皂苷和芍药苷峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。计算回归方程分别为：Rg1：Y=376527.6801X-321.0534，r=1.0000；Re：Y=328135.4893X-569.1802，r=1.0000；Rb1：Y=272196.5638X+2797.8999，r=1.0000；芍药苷：Y=1335381.6741X-10139.8343，r=1.0000。表明人参皂苷Rg1在0.284～2.272μg，人参皂苷Re在0.432～3.456μg，人参皂苷Rb1在0.716～5.728μg，芍药苷在0.284～2.272μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.1.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液，重复进样5次，每次10μL，测定峰面积，计算RSD。得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、芍药苷峰面积的RSD分别为0.44%，0.39%，0.89%，0.92%，表明测定仪器的精密度良好。

2.2.1.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于0, 2, 4, 6, 8, 12h进行测定，计算供试品溶液人参皂苷和芍药苷的峰面积RSD。得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、芍药苷峰面积的RSD分别为1.7%，2.8%，1.7%，3.0%，表明样品溶液在12h内稳定。

2.2.1.5 重复性试验 称取同一批次样品6份，按供试品溶液制备方法制备供试液，精密吸取10μL进样，照上述色谱条件进行测定，计算供试品溶液人参皂苷和芍药苷的含量RSD。试验结果显示人参皂苷Rg1、Re、Rb1、芍药苷含量的RSD分别为2.6%，2.9%，2.4%，2.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.1.6 加样回收率试验 取已知人参皂苷和芍药苷含量的样品，分别加入一定浓度的对照品混合溶液0.8mL、1.0mL、1.2mL，按供试品溶液的制备方法制备，精密吸取10μL进样，测定人参皂苷和芍药苷峰面积，计算加样回收率。得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、芍药苷的加样回收率分别为101.7%、 102.4 %、100.9%、101.8%。

2.2.1.7 样品的测定 取三批样品按供试品溶液的制备方法分别制备供试液，测定加减四君子汤胃内漂浮片中人参皂苷和芍药苷的含量。结果显示三批制剂的人参皂苷平均含量为3.542mg/g，芍药苷平均含量为3.546mg/g，故规定加减四君子汤胃内漂浮片中人参皂苷的含量限度为2.834mg/g，芍药苷的含量限度为2.837mg/g。

2.2.2 紫外分光光度法测定制剂中总多糖含量

据文献报道，多糖成分具有免疫调节作用，能起到治疗慢性萎缩性胃炎的作用[13,14]。测定多糖含量常采用紫外可见分光光度法，经预试验证明采用苯酚-硫酸法测定多糖含量灵敏度高且重复性好，故将其作为该制剂质量的评价指标之一。

2.2.2.1 线性关系考察 精密吸取稀释后的的葡萄糖对照品母液0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.2mL，置于干燥的15mL具塞试管中，各加蒸馏水至2.0mL后，精密加入5%苯酚试剂1.0mL，浓硫酸5.0mL，摇匀，置沸水浴中加热15min，取出置冷水中凉至室温；精密吸取2.0mL蒸馏水置于干燥的15mL具塞试管中，同法操作为空白，在489.0nm处测定吸光度，绘制标准曲线。得回归方程：Y=0.0086X-0.026，r=0.9998。表明葡萄糖在16.328～97.968μg范围内具有良好的线性关系。

2.2.2.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液2.0mL，按线性关系考察项下方法操作，重复测定5次，记录吸光度，计算RSD。试验结果显示供试品溶液吸光度均值为0.442，RSD为2.2%，表明仪器的精密度良好。

2.2.2.3 稳定性试验 精密吸取供试品溶液2.0mL，按线性关系考察项下方法操作，每10min测定1次，1h后改为每30min测1次，记录吸光度，计算RSD。测得吸光度在180min之内保持稳定，RSD为0.25%。故各样品吸光度的测定均在180min内完成。

2.2.2.4 重复性试验 取同一批号样品按供试品溶液的制备方法制备6份。按线性关系考察项下方法操作测定吸光度，计算RSD。计算多糖含量RSD为3.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.2.5 加样回收率试验 取已知多糖含量的样品6份，分别精密加入1.56mg/mL葡萄糖对照品溶液1mL，按供试品溶液制备方法制备，测定供试液中多糖含量，计算加样回收率。测得供试液中多糖平均加样回收率为100.5%，RSD为2.6%。

取三批样品，按供试品溶液的制备方法分别制备供试液，按线性关系考察项下方法操作，测定加减四君子汤胃内漂浮片中总多糖的含量。三批制剂的平均含量为132.6mg/g，故规定加减四君子汤胃内漂浮片中多糖的含量限度为106.1mg/g。

3 讨论

3.1 本试验从定性鉴别、含量测定两方面建立了加减四君子汤胃内漂浮片的质量控制方法，方法专属性强、灵敏、可靠。

3.2 采用薄层色谱法建立了人参、白芍的定性鉴别。薄层色谱斑点清晰，分离效果好，阴性对照无干扰，方法灵敏、可靠、专属性强。

3.3 加减四君子汤胃内漂浮片中人参为君药，人参皂苷是其主要有效成分，常被用来作为人参制剂的定量指标；白芍为处方增加的药味，芍药苷是其主要有效成分；总多糖是本处方制剂的主要有效成分之一，因此质量控制方法中的含量测定主要以人参皂苷Rg1、Re、Rb1及芍药苷、总多糖为考察指标进行。采用HPLC法对人参皂苷、芍药苷进行含量测定，结果样品分离效果理想，阴性空白不干扰测定，采用UV显色法对总多糖含量进行检测，

本试验只对三批样品进行了含量测定，取三批样品平均值下浮20%作为含量限度。经过方法学考察表明，制定的测定方法重复性、精密度、稳定性均良好，回收率符合要求。实验制备的加减四君子汤胃内漂浮片符合2010版《中国药典》[15]对片剂所做的规定，质量稳定可控，能保证用药的安全、有效。

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