内毒素加肥甘饮食建立大鼠湿热模型的效果研究*

★ 李华锋 张竞之 区鸿斌

(广州医科大学第二附属医院中医科 广东 广州 510260)

湿热证是临床上常见的病证，包括外感湿热病证和内伤湿热病证。对于湿热证的动物模型研究，目前应用较多的造模方法主要有两种，一是湿热环境+高脂饮食+细菌感染，二是高脂饮食+内毒素。前者多用于湿热证急性造模，缺点是长期的湿热环境可能造成动物的大量死亡，而且急性模型的应用限制性也很大。对于第二种方法，目前的研究都是以兔为动物模型，没有用大鼠做为动物模型，而大鼠在炎症因子的信号传导通路及因子的活化表达上与人更为接近，能否以大鼠为模型制造出更接近人体的湿热证模型，国内外尚无相关研究。本实验即从这一思路入手，分别用肥甘饮食、内毒素、肥甘饮食+内毒素的方法建立大鼠的湿热模型，以比较不同方法造模的效果差别，并探讨大鼠湿热模型成模的机制及改进手段。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 80只6～8周龄SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体重80～100g，购自中山大学实验动物中心。动物合格证号：粤检证字SCXK(粤)-2004-0011。

1.1.2 材料和仪器 ELISA相关试剂盒购自武汉博士德公司，兔抗大鼠IL-2或NF-κB及羊抗兔二抗购自美国SantCruz公司，大肠杆菌内毒素购自Promega公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物分组及处理 80只大鼠，随机分为4组，每组20只，雌雄各半。第1组(正常组)予正常饮食，第2组予肥甘饮食(5%猪油、3%鸡蛋黄、5%蜂蜜掺入普通饲料)造模，第3组以内毒素(鼠尾静脉注射大肠杆菌内毒素2μg/kg，每周2次)造模，第4组以肥甘饮食+内毒素造模。各组均造模6周后，取大鼠腹主动脉血检测IL-2、NF-κB的表达水平。

1.2.2 ELISA测定IL-2、NF-κB的表达 采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗IL-2或NF-κB单抗包被于酶标板上，标准品和待测样品中的IL-2或NF-κB与单抗结合，加入生物素化的抗IL-2或NF-κB抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Steptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm波长处测吸光度值A，IL-2或NF-κB浓度与A值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中的IL-2或NF-κB浓度。

2 结果

2.1 各种大鼠体内IL-2的表达 正常组、肥甘饮食组、内毒素组大鼠IL-2的表达均为低表达，且3组之间无明显差别，肥甘饮食+内毒素组IL-2的表达较前3组明显升高(P<0.05)，见表1、图1。

2.2 各组大鼠体内NF-κB的表达 正常组、肥甘饮食组、内毒素组大鼠NF-κB的表达均为低表达，且3组之间无明显差别，肥甘饮食+内毒素组NF-κB的表达较前3组明显升高(P<0.05)，见表1、图1。

表1 各组样本IL-2、NF-κB的表达

注：1)与第1组比较，差异无显著性，P>0.05；2)与第1组比较，差异有显著性，P<0.05；3)与第2组比较，差异有显著性，P<0.05；4)与第3组比较，差异有显著性，P<0.05。

图1 ELISA检测各组样本

3 讨论

目前对湿热证本质的研究思路呈两大趋势：一是对临床湿热证患者相关指标进行检测，力图从免疫功能、微量元素、自由基水平、血脂代谢、电解质水平、致炎因子、脾胃功能等方面来揭示湿热证的本质；二是运用传统中医理论造模，对模型从病理、生化、免疫、微量元素、胃肠动力等多角度，多侧面探讨证的本质。目前多强调“湿”性致病因子在湿热中的作用，比如从电解质水平、水通道蛋白、杀菌通透性蛋白、血脂代谢、胃肠激素等方面探讨其本质；对于“热”性致病因子，目前仅认为与内毒素及其诱导的炎性细胞因子和抗内毒素、抗炎因子、体内氧化物与抗氧化物的活性失衡有关。但湿热缠绵难愈，相互交蒸，难分难解，探讨湿与热两类致病因子的相互作用是研究湿热证的突破口之一。

在本研究中，通过用内毒素与肥甘饮食的方法建立大鼠湿热模型，其中内毒素所启动的炎症因子可作为“热”致病因子作用的靶点，而肥甘饮食导致的血脂紊乱则为“湿”性致病因子提供了作用平台。本实验观察到，单用肥甘饮食或者单用内毒素的方法，是无法造成成功的湿热证模型的，肥甘饮食组或内毒素组的大鼠体内炎症水平与正常大鼠无明显差别，说明单独的“湿”或者单独的“热”都无法构成标准的湿热证模型，只有在“湿”的基础上启动“热”的因素，才能最终导致体内炎症因子的活化和湿热模型的成功建立，显然这一结果也符合中医学的理论，《临证指南医案》即指出：“初病湿热在经，久则瘀热入络。”说明湿热蕴蒸日久可以导致血瘀。

本实验同时发现，IL-2和NF-κB的活化可以作为湿热证建立的重要指标之一。NF-κB是一种具有多项转录调节作用的蛋白质，通过调节免疫和炎症相关因子及炎症递质的表达，在炎症和免疫反应中起枢纽作用。而作为NF-κB的下游炎症因子，IL-2在被启动基因转录后，最终可与大批细胞因子(如TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8等)、粘附分子、组织因子、血管紧张素原、诱生型一氧化氮合酶、诱生型环氧合酶、MCP-1等一起大量表达，通过促炎作用导致湿热证和体内非特异性炎症的发生发展。这与已有的研究是一致的[1]。究其原因，可能是因为在湿热证动物模型中，生物致病因子能够成功的模拟“热”，亦即内毒素及其诱导的炎性细胞因子等可被认为是“热”性致病因子，体内的炎症水平必须要建立在血脂紊乱的基础上才能导致机体内环境的紊乱和功能的失调，最终导致湿热证的发生。

[1]Pahl HL. Activators and target genes of Rel/NF-kappB transcription factors[J]. Oncogene, 1999，18(49):6 853-6 866.