清泻浊毒方治疗急性痛风性关节炎大鼠的机制研究※

姜 萍 王占奎

(山东中医药大学中医内科教研室，山东 济南 250355)

实验研究

清泻浊毒方治疗急性痛风性关节炎大鼠的机制研究※

姜 萍 王占奎△

(山东中医药大学中医内科教研室，山东 济南 250355)

目的观察清泻浊毒法对急性痛风性关节炎大鼠的作用，并探讨其机制。方法将40只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、清泻浊毒方组及吲哚美辛组，每组10只。空白组、模型组每日灌胃0.9%氯化钠注射液2mL，清泻浊毒方组灌胃清泻浊毒方药液2mL，吲哚美辛组灌胃吲哚美辛肠溶片药液2mL，连续4d。模型组、清泻浊毒方组及吲哚美辛组大鼠采用尿酸钠混悬液注入大鼠踝关节腔造成急性痛风性关节炎模型；空白组注入0.9%氯化钠注射液对照。造模后按原方案继续灌胃给药，每日1次，连续3d。观察比较各组大鼠造模前及造模72h后的体质量、步态变化及末次灌胃1 h后关节组织中的基质金属蛋白酶(MMP-3)水平含量。结果造模72h后较造模前仅空白组体质量明显增加(P<0.01)，但从体质量增减程度比较，清泻浊毒方组分别与模型组及吲哚美辛组比较体质量增加明显(P<0.01)；造模72h后较造模前模型组、清泻浊毒方组及吲哚美辛组步态分级情况与正常组比较均有明显改变(P<0.01)，清泻浊毒方组及吲哚美辛组步态分级情况与模型组比较有明显改善(P<0.01)，且2组效果相当(P>0.05)；模型组大鼠末次灌胃1 h后关节组织MMP-3水平较空白组比较明显增加(P<0.01)，清泻浊毒方组及吲哚美辛组与模型组比较MMP-3水平均有下降趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论清泻浊毒方能够明显改善急性痛风性关节炎大鼠的关节步态和整体功能，且胃肠道副作用小，其作用机制与降低MMP-3水平无明显相关。

关节炎，痛风性；祛邪；疾病模型，动物；大鼠；中医疗法

近年来，痛风的发病率呈逐年递增、年轻化趋势，急性痛风性关节炎是其主要表现形式，目前控制其发作的主要药物有秋水仙碱、非甾体抗炎药及激素等，虽然缓解症状较快，但停药后容易复发且副作用明显，限制了其临床应用[1]。中医药治疗急性痛风性关节炎疗效显著，毒副作用较小，已越来越受到关注。周翠英教授认为急性痛风性关节炎的病机为“湿热浊毒流注，积聚关节而发”[2]，我们总结历代医家及多年的临床经验，以清泻浊毒法为治法，反复筛选药物，拟定清泻浊毒方为基础方治疗，疗效显著。本实验拟观察清泻浊毒方对急性痛风性关节炎大鼠模型的影响，探讨其作用机制，为进一步临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 清洁级雄性Wistar大鼠40只，体质量(200±22) g，由山东大学医学院动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK(鲁20090001)。

1.1.2 药品及试剂 中药清泻浊毒方(药物组成：金银花20g，蒲公英30g，土茯苓30g，熟大黄15g)，由山东中医药大学附属医院制剂室煎煮浓缩成含生药1.71 g/mL的溶液；吲哚美辛肠溶片(山西云鹏制药有限公司，国药准字H14020771，批号A090902)，配制成浓度为0.50mg/mL的混悬液，均置入4℃冰箱冷藏备用；尿酸钠(美国SIGMA公司，批号120K535)，取0.2g尿酸钠加入4mL 0.9%氯化钠注射液，配制成5%的尿酸钠混悬液备用；基质金属蛋白酶(MMP-3)酶联免疫检测试剂盒(美国R&D Systems公司，批号BP-E69605R)。

1.1.3 仪器 AV2101电子分析天平，梅特勒托利多仪器(上海)有限公司；DT5-3台式离心机，北京时代北利离心机有限公司；REX-C400电热恒温水浴箱，北京市永光明医疗仪器厂；雷杜RT6000酶标仪和雷杜RT3000洗板机，深圳雷杜生命科学股份有限公司；AU2700型全自动生化分析仪，日本OLYMPUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 全部40只大鼠适应环境饲养1周后，按随机数字表达法分为：空白组、模型组、清泻浊毒方组及吲哚美辛组，每组10只。空白组、模型组每日灌胃0.9%氯化钠注射液2mL，清泻浊毒方组灌胃清泻浊毒方药液2mL，吲哚美辛组灌胃吲哚美辛肠溶片药液2mL，连续4d。

1.2.2 造模方法 模型组、清泻浊毒方组及吲哚美辛组大鼠采用4号注射器将50μL尿酸钠混悬液注入大鼠踝关节腔，造成急性痛风性关节炎模型；空白组注入0.9%氯化钠注射液50μL。造模后按原方案继续灌胃给药，每日1次，连续3d。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 对体质量的影响 分别观察测量各组大鼠造模前及造模72h后的体质量变化，观察药物对大鼠胃肠功能的影响。

1.3.2 对步态变化的影响 参照Coderre的步态分级标准分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级[3]，观察造模72h后各组大鼠步态变化，记录每组中异常步态的大鼠数目。

1.3.3 对关节组织MMP-3含量的影响 末次灌胃1 h后，各组大鼠采用脱颈椎处死，按相关文献方法[4-5]，在右踝关节上0.5cm处剪断，切开受试关节囊，用1 mL 0.9%氯化钠注射液灌洗关节腔，收集关节液，然后用锐利刀片切取少量关节囊、滑膜等周围软组织，制成匀浆，与关节冲洗液同用3000r/min离心，取上清液，采用MMP-3酶联免疫检测试剂盒测定MMP-3的含量。

2 结 果

2.1 各组大鼠造模前及造模72h后体质量的变化 见表1。

组 别n造模前造模后72h体质量增减空白组10213．80±12．78232．2±14．67∗17．00±5．14模型组10213．80±11．45214．4±13．7950．60±5．68△清泻浊毒方组10210．58±8．78220．75±13．7611．67±9．93吲哚美辛组10216．10±4．58212．20±10．08-2．90±9．37△

与本组造模前比较，*P<0.01；与清泻浊毒方组比较，△P<0.01

由表1可见，造模72h后，空白组、模型组及清泻浊毒方组大鼠体质量增加，吲哚美辛组大鼠体质量减少，但仅空白组较造模前比较差异有统计学意义(P<0.01)，其余均无统计学意义(P>0.05)，但从体质量增减程度比较，清泻浊毒方组分别与模型组及吲哚美辛组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，清泻浊毒方组体质量增加明显。

2.2 各组大鼠造模72h后步态分级情况比较 见表2。

表2 各组大鼠造模72h后步态分级情况比较 只

经过Ridit分析，模型组、清泻浊毒方组及吲哚美辛组步态分级情况与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，均有明显改变；清泻浊毒方组及吲哚美辛组步态分级情况与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，且2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明2组均可改善大鼠步态，且疗效相当。

2.3.3 各组大鼠末次灌胃1 h后关节组织MMP-3水平情况比较 见表3。

组 别空白组(n=10)模型组(n=10)清泻浊毒方组(n=10)吲哚美辛组(n=10)MMP-322．99±2．9226．95±4．66∗26．36±4．3923．64±3．37

与空白组比较，*P<0.01

由表3可见，模型组大鼠末次灌胃1 h后关节组织MMP-3水平与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)，明显增加；清泻浊毒方组及吲哚美辛组与模型组比较，MMP-3水平均有下降趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

痛风属中医痹证范畴，中医学认为痛风发生的病因主要为风、湿、热、痰、瘀、虚、毒7种，对痛风性关节炎的认识也从单纯外感，到内外合邪，或者脏腑内生热毒直接流入关节发病。我们认为，痛风性关节炎的病机为脏腑积热蕴毒，外因诱发，致湿热浊毒流注于骨节而发病，故以清泻浊毒为治法。清泻浊毒方中金银花甘寒清芳，性偏宣散，既能泻脏腑之热，又能清解经络之毒，清热解毒而不伤阴，芳香透达而不蕴邪，配伍性寒味苦的蒲公英增强清热解毒、散结消肿之力，且能散滞气，利尿消肿，久用不伤脾胃，是痛风性关节炎首选的清热解毒药；土茯苓性味甘淡平，既能利湿除热去积毒，又能消肿通络利关节，大剂量应用善消关节肿胀而无伤阴之弊；大黄苦寒，泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经。二者配伍，土茯苓清热解毒、通利小便，熟大黄清热解毒、通腑泻热，使浊毒随二便泄下，清泄骨节中浊毒，祛除络中浊瘀而止痛。综观全方，选用金银花配伍蒲公英，清解热毒之力倍增而不伤阴；土茯苓联合熟大黄，使浊毒从大小便而解，清热解毒与泻下相互配伍，相使为用，相得益彰。我们前期的研究表明，清泻浊毒方有明显的临床疗效，其能够增加高尿酸血症大鼠的24h尿量、尿液尿酸浓度，增加24h尿酸的排泄[6]，从而达到治疗作用。

MMP-3是由滑膜细胞、软骨细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞分泌，它作用底物广泛，具有降解胶原蛋白、蛋白多糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等成分的能力。近年来研究发现，MMP-3在炎症反应中占重要地位，急性痛风性关节炎患者关节滑液中MMP-3浓度高于非炎性关节疾病，可作为反映关节滑膜炎症的指标之一[7]。踝关节注射尿酸钠后，关节液中的MMP-3均有不同程度的增加，经过清泻浊毒方和吲哚美辛灌胃后，关节液中的MMP-3浓度与模型组比较均有下降，但经统计学分析后无显著性差异，说明清泻浊毒方和吲哚美辛对模型大鼠关节液中升高的MMP-3水平改善不明显。

本实验结果表明，清泻浊毒方能够明显改善急性痛风性关节炎大鼠关节步态和整体功能，且胃肠道副作用小，对大鼠的消化吸收没有明显影响，对大鼠关节滑液中的MMP-3浓度有一定的降低作用，但不明显，说明其作用机制与降低MMP-3水平无明显相关，可能与疗程和样本数量有关，也可能存在其他作用机制，有待进一步探讨。

[1] 张奉春.风湿病学新进展[M]．北京：中华医学电子音像出版社，2005：208．

[2] 周海蓉.周翠英治疗痛风性关节炎经验[J].山东中医杂志，2000，19(10):618-619.

[3] Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti-arthritic agents[J].Pharmacol Biochem Behav，1988，29(3):461-466.

[4] 黄金玲，龙子江，吴华强，等.苓桂术甘汤对佐剂性关节炎大鼠关节液IL-1β、TNFα及PGE2的影响[J].中国中医药科技，2004，11(2):75-76.

[5] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1993：369-371．

[6] 姜萍，王占奎.清泻浊毒法对高尿酸血症大鼠尿量及尿酸水平的影响[J].世界中西医结合杂志，2013，8(6):605-607.

[7] Liu R，Liote F，Rose DM，et al.Proline-rich tyrosine kinase 2and Src kinase signaling transduce monosodium urate crystal-induced nitric oxide production and matrix metalloproteinase 3expression in chondrocytes[J].Arthritis Rheum，2004，50(1):247-258.

(本文编辑：石 康)

Mechanismresearchofaprescriptionforclearingturbidandpoisononacutegoutyarthritisrats

JIANGPing,WANGZhankui.

TraditionalChineseMedicineInternalMedicineDepartment,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shandong,Jinan250355

ObjectiveTo research the mechanism of a prescription for clearing turbid and poison on acute gouty arthritis rats.Methods40Wistar rats were randomly divided into blank group, model group, a prescription for clearing turbid and poison group and indometacin group, 10rats in each group. Rats in blank group and model group

0.9% sodium chloride injection 2mL, once a day. Rats in a prescription for clearing turbid and poison group and indometacin group received a prescription for clearing turbid and poison and Indometacin Enteric-coated Tablets soup 2mL, once a day for four day. Acute gouty arthritis model rats in a prescription for clearing turbid and poison group and indometacin group were established by sodium urate suspension injected into the cavity ankle of rats. Rats in blank group and model group received the cavity ankle injection of 0.9% sodium chloride. After modeling the original program continued gavage once daily, continuous 3d. Comparison of body mass were observed before modeling and 72h after modeling, gait changes and joint tissue matrix metalloproteinase (MMP-3) levels of content 1 h after the last administration were observed.ResultsBody mass 72h after modeling was increased significantly only in blank group compared with that before modeling (P<0.01). Compare the degree of change in body weight from, body mass 72h after modeling in a prescription for clearing turbid and poison group was increased significantly compared with that in model group and indometacin group (P<0.01). Gait classification situation a prescription for clearing turbid and poison group and indometacin group were obviously improved in comparison with that in model group (P<0.01). Joint tissue MMP-3levels of content 1 h after the last administration in model group were increased compared with those in blank group (P<0.01). There was no significant difference between three groups on tissue MMP-3levels (P>0.05).ConclusionA prescription for clearing turbid and poison can significantly improve gait and the overall function of acute gouty arthritis rats, and gastrointestinal side effects is small, its action mechanism is not obviously associated with lowering levels of MMP - 3.

Arthritis, Gouty; Eliminating evil; Disease models, Animal; Rats; Traditional Chinese medicine therapy

※ 项目来源：山东省高等学校科技计划资助项目(编号：J12LK11)；全国名老中医药专家周翠英传承工作室建设项目

姜萍(1973—)，女，副主任医师，副教授，博士。从事中医风湿免疫病的临床及实验研究。

R289.61；R684.3

A

1002-2619(2014)07-1071-03

2013-07-11)

△ 通讯作者：山东中医药大学附属医院风湿科，山东 济南 250011