一种靶向FAP的蛋白疫苗设计及其抗肿瘤保护研究

张 莉， 陈扬扬， 祝先潮， 李荣秀

(上海交通大学 生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室，上海 200240)

一种靶向FAP的蛋白疫苗设计及其抗肿瘤保护研究

张 莉， 陈扬扬， 祝先潮， 李荣秀

(上海交通大学 生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室，上海 200240)

设计了一种成纤维细胞活化蛋白(FAP)催化结构域与白喉毒素跨膜结构域(DTT)融合的蛋白疫苗并研究了其抗肿瘤保护效果.通过基因重组，构建了FAP催化结构域与DTT的融合蛋白DTT-FAP.融合蛋白经大肠杆菌表达后，由GST柱进行亲和纯化.DTT-FAP免疫Balb/c小鼠后，接种结肠癌CT26实体瘤.ELISA检测血清效价，并研究其抗肿瘤保护效果.DTT-FAP引起了相应的免疫反应，血清效价约5×103.该疫苗显著抑制CT26肿瘤生长(p<0.01)，并显著提高小鼠生存率(p<0.01).本研究首次构建了以FAP为靶点的蛋白疫苗DTT-FAP，该疫苗可引起小鼠针对人FAP的免疫反应，并对结肠癌CT26实体瘤有显著抗肿瘤保护效果.

FAP；融合蛋白；疫苗；CT26；抗肿瘤保护效果

引 言

成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)是特异性表达于肿瘤相关成纤维细胞(carnicinoma associated fibroblasts, CAFs)的一种膜蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族[1,2].FAP在90%以上恶性上皮肿瘤(包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和卵巢癌等)的基质中都有特异性的高表达，在胚胎组织、愈合创面及生理性重建的器官中也有瞬态的少量表达，而在正常人体组织中无表达[3].研究表明，敲除FAP可以抑制肿瘤免疫逃逸，实现机体对肿瘤的免疫应答[4].过表达FAP会促进肿瘤微血管的生成并促进肿瘤生长[5].FAP在癌间质中的作用机制尚未得到充分的研究.目前科学界较为普遍的观点是FAP在肿瘤相关成纤维细胞上的表达对于形成肿瘤生长的微环境较为重要，尤其是FAP的酶活性.其在肿瘤的发生发展中主要有两方面的作用[1,6]：(1)通过发挥蛋白水解酶作用，解离与基质蛋白结合的生长因子(如肽类生长因子、趋化因子)，并进行修饰，使这些生长因子发挥促进肿瘤微血管生成和促进肿瘤生长的作用.(2)通过胶原酶活性溶解与肿瘤细胞相邻的细胞外基质，参与细胞间质重塑，或者激活某些蛋白酶而间接作用，从而协助癌细胞的浸润和侵袭.因此本研究选取FAP作为治疗靶点.

目前，以FAP为治疗靶点的治疗策略主要有单克隆抗体、FAP酶活抑制剂、FAP激活式靶向前体药物和DNA疫苗.单抗药物[7]和FAP酶活抑制剂[8]在目前的临床研究中效果有限，且单抗药物治疗成本高昂.DNA[9]疫苗效果在动物实验中通过激发CTL效应，表现出良好的抗肿瘤效果，这预示着对于FAP靶点，激发CTL效应是关键.因此，本研究选用弗氏佐剂作为免疫佐剂，以期同时激发体液免疫和CTL效应.不过，DNA疫苗的安全性一直令人担忧.蛋白疫苗一般具有更好的安全性，且更易进行质量控制.针对FAP靶点的蛋白疫苗目前还未见报道.因此，本研究以FAP为治疗靶标，选取人FAP酶活结构域与白喉毒素跨膜结构域(diphtheria toxin transmembrane, DTT)的羧基端融合，构建融合蛋白疫苗FAP-DTT.将机体的免疫反应聚焦至FAP的催化结构域，并缩小重组蛋白体积，实现原核表达，降低重组疫苗生产成本.利用DTT上丰富的B细胞表位和T细胞表位[10]刺激机体产生针对FAP的免疫应答，从而抑制肿瘤的生长.以期为恶性上皮肿瘤治疗提供一种更经济、安全的新方法.

1 材料和方法

1.1实验材料

菌株E.coli BL21(DE3)，载体pGEX-6p-1/DTT，鼠结肠癌CT26细胞株(均为本实验室保存)，GST亲和层析柱(GE公司)，CT26细胞培养相关试剂(Gibco公司)，羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，6-8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠(常州卡文斯)，重组人FAP(R&D System)，引物合成(南京金斯瑞).

1.2实验方法

1.2.1 疫苗设计与载体构建 鼠FAP与人FAP的氨基酸序列同源性高达91%，尤其是酶活结构域高达92%.因此我们选取人FAP的氨基酸序列进行抗原设计.为将机体的免疫反应聚焦到FAP的酶活结构域上，同时减小融合蛋白的大小，以实现融合蛋白的原核生物表达，仅将FAP的酶活结构域DTT蛋白的羧基端(C端)融合.根据报道，DTT的氨基酸序列为202-378[11,12]，FAP上包含催化三联体的酶活结构域氨基酸序列为500-761[13].登录NCBI网站，分别下载人FAP的氨基酸序列及核酸序列，确认FAP氨基酸序列500-761对应的核酸序列.根据重叠延伸PCR原理，设计引物如表1.经PCR扩增分别获得上下模板.重叠延伸PCR拼接上下模板.经BamHI和XhoI双酶切并回收，连接pGEX-6P-1载体.

表1 引物序列Table 1 the list of primers

将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，氨苄抗性平板筛选阳性克隆.用头尾引物进行PCR扩增，鉴定阳性克隆中是否含有重组基因片段.之后将阳性克隆质粒送南京金斯瑞测序，并比对是否完全正确.将序列正确的阳性克隆质粒转入大肠杆菌BL23(DE3)，并保种，进行重组蛋白的表达纯化.

1.2.2 重组蛋白表达与纯化 将菌株进行小量发酵，并用终浓度1mM的IPTG诱导，筛选获得表达目的蛋白的克隆.大量发酵获得菌体，经超声破碎，收集上清进行GST柱亲和纯化获得目的蛋白.收集带GST标签的重组蛋白，用PSP酶切除GST标签.酶切充分后，GST柱吸附GST蛋白，去除GST蛋白.浓缩后，进行SDS-PAGE电泳鉴定，分析蛋白纯度，并采用BCA试剂盒进行蛋白定量.分装并加15%甘油后于-80℃保存备用.

1.2.3 小鼠免疫 将30只雌性Balb/c小鼠随机分为3组，每组10只.分别以DTT-FAP、DTT和生理盐水作为抗原.DTT和生理盐水2组为对照组.将抗原用生理盐水稀释成0.3 mg/mL，按1:1比例与弗氏佐剂混匀并乳化.第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次和第三次采用不完全弗氏佐剂.采用背部皮下多点注射的方式进行免疫，200μL/只/次.每2周加强免疫一次，共3次.免疫前1天和第三次免疫后一周通过眼眶取血，经静置及离心，收集血清并于-20℃保存备用.

1.2.4 血清学研究 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测抗血清效价.用包被液稀释重组人FAP至1μg/ml，每孔包被100μL，4℃孵育过夜，洗涤液洗板6次，拍干.每孔用300μL封闭液封闭1h，洗板6次，拍干.被测血清用样品稀释液分别稀释100倍、500倍、1000倍、5000倍、10000倍、50000倍、1000000倍.每孔加100μL抗血清，37℃孵育1.5h，洗板6次，拍干.每孔加酶标二抗(1:10000)100μL，37℃孵育1 h，洗板6次，拍干.加底物TMB，每孔100μL，37℃，10 min.加终止液50μL，用酶标仪进行测定吸光值.扣除A630背景值，测A450.做A450对稀释倍数的曲线.采用A450>0.2且P/N≥2.1时(即实验组与对照组的吸光值A450之比≥2.1时)的最大稀释倍数作为抗血清的效价.

1.2.5 抗肿瘤保护效果研究 完成三次免疫一周后接种CT26实体瘤，构建肿瘤模型.第四代鼠源结肠癌CT26细胞系培养3天后，经胰蛋白酶消化后转移至PBS溶液.细胞溶液用200目筛网进行筛分，以保证滤液中的细胞均为单细胞.采用25×16血球板进行计数，记录四个角上的4个中格中的细胞数目，采用“记左不计右，记上不记下”的方式进行计数.细胞浓度计算公式为：4个中格中细胞数目平均值×104个/mL.调整细胞浓度为1.78×106个/mL.完成第三次免疫一周后接瘤，在小鼠右前侧接瘤，每只小鼠接种100μL.之后每3天观察一次肿瘤形成情况，测量并记录肿瘤大小.接瘤后27天，处死小鼠.

1.2.6 数据统计及分析 肿瘤大小计算公式如下：肿瘤体积=a*b2/2mm3[14]，其中a表示肿瘤长径，b表示肿瘤宽径.统计小鼠肿瘤的生长数据及生存率数据，并采用Graphpad Prism 5.0软件进行统计分析并制图，采用t检验对数据差异显著性进行分析，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示p<0.001.

2 结果

2.1载体构建

根据重叠延伸PCR原理，经PCR扩增分别获得了上下模板，并通过重叠PCR进行拼接.酶切回收并转入DH5α进行鉴定.重组基因理论大小约1300bp，以头尾质粒为引物，将转化后的质粒进行重叠PCR，电泳检测结果显示转入的基因片段与理论大小相符合(如图1).挑取阳性克隆，送南京金斯瑞公司测序.结果经比对，构建的片段序列完全正确，DTT-FAP重组质粒构建成功.

2.2重组蛋白纯化

筛选到表达可溶目的蛋白的菌株后进行发酵纯化.经GST柱亲和纯化获得带GST标签的目的蛋白.经PSP酶切除GST标签，并用GST柱亲和柱吸附除去GST蛋白.切除GST标签的DTT-FAP蛋白理论大小为51kD，SDS-PAGE结果显示纯化获得的蛋白大小符合预期(如图2)，且纯度在90%以上，BCA法测得蛋白浓度为0.87mg/mL，可用于后续动物免疫试验.

图1 重叠PCR验证重组基因片段Fig 1 validation of recombinant gene by overlap PCR

图2 重组蛋白SDS-PAGE结果Fig 2 SDS-PAGE result of purified recombinant protein

2.3血清学研究

将完成3次免疫后一周的小鼠抗血清稀释100倍进行ELISA检测，结果显示DTT-FAP组激发了针对人FAP的抗体，而对照组DTT组和生理盐水组均未产生(p<0.01)(如图3).将小鼠抗血清进行梯度稀释，并ELISA检测450nm处吸光值，做A450对稀释倍数曲线图，测得抗血清针对人FAP的效价约5×103(如图4).表明该重组蛋白疫苗激发了Balb/c小鼠针对人FAP的免疫应答.

图3 三免后血清针对FAP的抗体Fig 3 serum antibody of FAP after 3 vaccinations

图4 三免血清抗FAP效价Fig 4 anti-FAP titers of serum after 3 vaccinations

2.4抗肿瘤保护效果

完成三次免疫后一周，接种结肠癌CT26构建实体瘤模型.DTT-FAP免疫显著抑制了肿瘤的生长(p<0.01)(如图5).接瘤后28天，处死小鼠取出肿瘤，DTT-FAP组肿瘤与对照组相比，明显较小，如图6(3组肿瘤大小均已在图5中体现，照片仅显示了DTT组和DTT-FAP组小鼠肿瘤以直观表明其差异).接瘤后第27天，DTT-FAP组小鼠的存活率为80%，而其他各组的小鼠存活率均在30%以下(如图7)，DTT-FAP提高的荷瘤小鼠的生存率(p<0.01).以上结果均表明小鼠针对FAP催化结构域的免疫反应具有显著的抗肿瘤保护效果.

图5 肿瘤生长曲线Fig 5 growth curve of tumors

图6 肿瘤照片Fig 6 the tumors picture

图7 生存率曲线Fig 7 the survival rate curve

3 讨论

FAP[1,9]与肿瘤的发生发展有着密切的联系，尤其是其酶活性与肿瘤的浸润和侵袭有着重要作用.其特异性表达于上皮肿瘤细胞的癌间质，具有良好的特异性，且基因组稳定，是非常好的肿瘤治疗靶点.目前，以FAP为靶点的癌症治疗方法主要有单抗、酶抑制剂和DNA疫苗.单抗和酶抑制剂[7,8]的临床治疗效果有限，且单抗治疗成本高昂，DNA疫苗[9]效果在动物实验中表现出良好的效果，但是其安全性存在很大的问题.本研究率先设计了FAP结构域与DTT融合的重组蛋白疫苗，该疫苗可引起小鼠对人FAP的免疫反应，而人FAP与鼠FAP的同源性高达90%，这意味着类似突破了小鼠的自身免疫耐受.且该疫苗免疫后，显著抑制肿瘤生长，提高小鼠生存率，具有显著抗肿瘤保护效果.与单抗药物相比，该重组蛋白疫苗分子较小，可以通过原核表达进行大规模生产，生产成本大幅降低.与DNA疫苗相比，蛋白疫苗更容易进行质量控制，安全性更加可靠.本研究首次提供了针对FAP靶点的蛋白候选疫苗，有望为治疗恶性上皮肿瘤提供一种更经济、安全的新方法.

该重组蛋白将小鼠的免疫反应聚焦至FAP的催化结构域，而CT26实体瘤模型中，DTT-FAP显著抑制肿瘤生长，并提高荷瘤小鼠的生存率，表明小鼠针对FAP催化结构域的免疫反应具有抗肿瘤保护效果.这意味着FAP促进肿瘤生长的作用与其酶活性有密切的关系，与Park等[13]和Cheng[6]等的研究结果一致.小鼠针对FAP的抗体滴度偏低，而抗肿瘤效果较为明显，很可能是因为DTT-FAP在激发体液免疫的同时激发了CTL效应，具有显著抗肿瘤保护效果的DNA疫苗也是通过细胞免疫途径实现的[9].对于该疫苗具体的作用机制，本实验室将继续进行进一步的深入探讨.

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DevelopmentandAnti-TumorProtectiveEffectsStudyofaFAP-TargetingRecombinantProteinVaccine

ZHANG Li， CHEN Yang-yang， ZHU Xian-chao， LI Rong-xiu

(School of Life Science and Biotechnology， Shanghai Jiao Tong University， State Key Laboratory of Microbial Metabolism，Shanghai 200240，China)

The paper developed a recombinant protein vaccine which fuses fibroblast activation protein (FAP)catalytic domain and diphtheria toxin transmembrane (DTT)and studied its anti-tumor protective effects. With gene engineering technology, it constructed the fused protein DTT-FAP of FAP catalytic domain and DTT. Recombinant protein was expressed by E.coli, purified by GST affinity column. ELISA was performed after mice vaccination. Solid tumor model of CT26 was established to evaluate the tumor protection effect. DTT-FAP induced specific immune response, and the tilter is about 5×103. DTT-FAP remarkably suppressed CT26 tumor growth (p<0.01)and improved the survival rate (p<0.01). This studyfor the 1st time developed anti-FAP protein vaccine DTT-FAP, which could induce anti-hFAP immune response and remarkably protect the mice from CT 26 tumor.

FAP; recombinant protein; vaccine; CT26; anti-tumor protective effects

2014-04-13

国家科技重大专项(2014ZX09101043-002).

张莉(1990-)，女，四川人，硕士研究生，研究方向为肿瘤疫苗.

张莉，陈扬扬，祝先潮，等.一种靶向FAP的蛋白疫苗设计及其抗肿瘤保护研究[J].安徽师范大学学报：自然科学版，2014，37(4)：366-370.

R392.11

A

1001-2443(2014)04-0366-05