艰难梭菌临床分离株5年前后耐药性变化

周芬芬，吴 湜，徐少华，黄海辉

艰难梭菌（Clostridium difficile）是医院获得感染性腹泻最主要的病原菌，在抗生素相关性腹泻中占20%～30%，而假膜性肠炎则几乎90%以上均由艰难梭菌所致，统称为艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）。自2002年起北美和欧洲相继发生100多次CDI暴发流行，主要与高产毒株核糖体型027有关［1］。当前北美仍以核糖体型027为最多见；欧洲2008年之后其他核糖体型如014／020、078等逐渐成为主要流行株［2］。国内近年来对CDI亦越来越重视，Huang等［3］和陈云波等［4］报道CDI占医院感染性腹泻的9.5%～30.7%，但我国迄今为止尚未有核糖体型027感染的报道。

抗菌药物的应用是CDI的最主要危险因素。艰难梭菌对多种抗菌药物耐药，在核糖体型027等高毒株的广泛传播中亦具重要作用［1］。Oka等［5］和Ilchmann等［6］报道艰难梭菌对克林霉素和红霉素的耐药率超过80%，对莫西沙星的耐药率高达56%。国内流行株核糖体型017对红霉素、莫西沙星、克林霉素等抗菌药物的耐药率亦超过50%［7］。甲硝唑和万古霉素迄今仍为治疗CDI的一线药物［8］，但近期亦有报道艰难梭菌对这2种药物的敏感性有所下降［9］。本课题对复旦大学附属华山医院5年前后的艰难梭菌临床分离株耐药性和核糖体分型的变化进行了研究，为制定CDI的防治策略提供参考。

材料与方法

一、材料

（一）菌株来源 收集2007年8月—2008年7月和2012年8月—2013年7月我院医院获得性腹泻患者粪便中分别分离到的74株与64株艰难梭菌，经革兰染色及PCR扩增gluD基因阳性鉴定。剔除重复菌株。

（二）培养基及抗菌药物 CCFA（头孢甲氧噻吩－环丝氨酸－果糖－琼脂）选择培养基为英国OXIOD公司产品；Brucella琼脂培养基为美国BD公司产品；抗菌药物包括甲硝唑、万古霉素、红霉素、莫西沙星、夫西地酸、左氧氟沙星、克林霉素、四环素、利福平和亚胺培南为美国Sigma－aldrich公司产品。

（三）主要仪器及试剂 细胞毒素中和试验试剂盒为美国Techlab公司产品；Concept 400厌氧工作站为英国Ruskinn公司产品，多重实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）仪 为 美 国Cepheid公司产品；HotStarTaq Master Mix试剂盒为德国QIAGEN公司产品。

二、方法

（一）毒素检测 采用普通PCR检测tcdA基因，多重实时PCR检测tcdB、cdtA、cdtB基因。另以细胞毒中和试验对毒素B加以确证。

（二）核糖体分型和多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 采用 PCR 核糖体分型法［10］对所有分离到的产毒株进行分型。PCR核糖分型图谱参照英国公共卫生实验室厌氧菌参考实验室 ［Public Health Laboratory Services （PHLS）Anaerobic Reference Unit，Cardiff］标准菌株图谱（部分）。如图谱与标准菌株图谱一致，则按标准株核糖体型命名，例如核糖体型027；反之则以英文字母如 A、B、C、等顺序分型［7］。部分菌株采用Stabler等［11］推荐的方法测定 MLST，以7个管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi）作 为 目 标测序基因，在www.mlst.net网站上进行分析，得出序列型。

（三）抗菌药物敏感性试验 按CLSI推荐的琼脂稀释法测定10种抗菌药物对艰难梭菌的MIC。药敏试验培养基采用Brucella琼脂添加5 mg／L血红素，1 mg／L维生素K以及5%脱纤维羊血。按CLSI 2011年版M11－A8推荐艰难梭菌琼脂稀释法接种菌液为107CFU／mL，接种菌量为104CFU／点［12］。37℃厌氧培养48 h。按 CLSI 2007年版M11－A7以及2013年版M100－S23标准判读药敏试验结果。CLSI无确切判断标准药物的耐药折点，按文献［13－14］报道：万古霉素≥32 mg／L；红霉素≥8 mg／L；利福平≥4 mg／L；左氧氟沙星≥8 mg／L；夫西地酸＞0.5 mg／L。质控菌株为艰难梭菌ATCC700057和脆弱拟杆菌ATCC 25285。对3类以上不同化学结构的抗菌药物耐药的菌株为多重耐药株。

三、统计学分析

采用SPSS 16.0软件计算 MIC50和 MIC90。

结 果

一、毒素与核糖体分型

2007年8月—2008年7月与2012年8月—2013年7月分别获得74株与64株艰难梭菌产毒株。5年前分离到的74株菌中，23株仅产B毒素（A－B＋，31.1%），49株产 A、B两种毒素（A＋B＋，66.2%），2株同时产A、B两种毒素和二元毒素（A＋B＋CDT＋，2.7%）。74株菌分别属于18个核糖体型，以核糖体型017（A－B＋，24.3%）最为常见。5年后的64株临床分离株中，22株为A－B＋，占34.4%；42株为A＋B＋，占65.6%。共检测到18个核糖体型，以核糖体型 H（A－B＋，18.8%）最为常见，其次为核糖体型017和012，见表1。H型菌株MLST结果为ST－81型。

二、药敏试验分析

138株艰难梭菌对抗菌药物的敏感性见表2。所有菌株对甲硝唑和万古霉素均呈高度敏感。2012—2013年临床分离株中，分别有26.6%、67.2%、65.6%和28.1%的菌株对莫西沙星（MIC≥32 mg／L）、红霉素（MIC＞128 mg／L）、克林霉素（MIC＞128 mg／L）和四环素（MIC≥32 mg／L）呈高度耐药；32.8%（21／64）的菌株同时对红霉素、克林霉素、莫西沙星和四环素呈多重耐药，其中81.0%（17／21）的多重耐药菌株属于核糖体 H型（12／21）和017型（5／21）。与5年前相比，艰难梭菌临床分离株对克林霉素耐药率由74.3%升至84.4%、对四环素由39.2%升至48.4%、对夫西地酸由25.7%升至35.9%，耐药率呈升高趋势，并出现了亚胺培南耐药株；但对左氧氟沙星和利福平的耐药率则出现下降趋势，分别由78.4%和20.3%降至47.4和7.8%。同时5年后多重耐药株（32.8%）的比率亦高于5年前（28.3%）。

表1 艰难梭菌临床分离株5年前后的毒素类别及核糖体分型Table 1 Ribotypes and toxin profiles of clinical Clostridium difficile isolates during two periods with an interval of 5 years

表2 比较10种抗菌药物对艰难梭菌5年前后临床分离株的最低抑菌浓度Table 2 Minimum inhibitory concentrations（MICs）of 10 antimicrobial agents against the Clostridium difficile isolates during two periods with an interval of 5 years

讨 论

虽然A＋B＋菌株在艰难梭菌感染中仍占主导地位，但是A－B＋菌株感染的报道亦非少见。欧洲和美国艰难梭菌临床分离株仍以A＋B＋菌株为主，A－B＋菌株总分离率为1%～3%［2，15］；但日本和韩国的艰难梭菌A－B＋产毒株临床分离率则上升至12.7%～21.4%［16－17］，我 国陈云 波等［4］和章黎华等［18］报道A－B＋产毒株占所有分离产毒株的34.0%～37.5%。亚洲国家A－B＋菌株的分离率明显高于欧美国家，有可能与核糖体型017（A－B＋）菌株在亚洲国家的流行有关［2，7，15］。本研究中临床分离株虽然总体来说以A＋B＋菌株为多见，但A－B＋菌株亦约占30%，与陈云波等［4］报道相仿。因此在国内医院的检验科若仅检测A毒素将有约1／3 CDI患者可能漏诊。

尽管核糖体型027菌株过去数年中在北美与欧洲广泛流行，但是亚洲的相关报道仍比较少，仅韩国、新加坡、日本与我国香港有零星报道。另一新流行株核糖体型078，在荷兰2005—2008年其分离率从3%迅速增长到13%，但本研究并未检测到。我院2007年8月—2008年7月艰难梭菌临床分离株以核糖体型017为主，5年后则以H型最多见，占18.8%。H型菌株MLST分型为ST－81型，与核糖体017型／ST－37具有较高的同源性［11］，且两者的毒素类别均为A－B＋。2012年上海中山医院曾在腹泻伴血流感染患者的粪便和血液中均分离到艰难梭菌，经检测这2株菌核糖体分型同为H型，提示该型菌株不仅导致腹泻，而且能引起更为严重且罕见的血流感染。

甲硝唑和万古霉素体外对艰难梭菌具有良好抗菌活性，耐药株罕见。然而2008年Peláez等［19］报道西班牙一所医院艰难梭菌临床分离株中12%菌株对甲硝唑呈异质性耐药，本课题组在前期也有类似报道［20］。但2012—2013年并未在分离到的新鲜菌株中检测到异质性耐药菌。与5年前相比，当前艰难梭菌临床分离株对多种抗菌药物的耐药率有所增高，其中对克林霉素、四环素、夫西地酸的耐药率约增高10个百分点，且对红霉素、克林霉素、莫西沙星和四环素耐药的多重耐药菌的比率亦上升至32.8%。耐药率的升高原因之一可能与近2年核糖体型017和 H型在医院内的流行相关（20／64，31.3%），因这2种类型的细菌多呈多重耐药；其次可能与抗生素选择性压力有关［21－22］，例如2007年我院多西环素和亚胺培南－西司他丁的用量分别为200DDDs和2 205.5DDDs，至2012年分别上升至2 896DDDs和3 675.8DDDs。

近10年来，艰难梭菌作为一种条件致病菌在感染性疾病中的重要性日渐增加。应重视CDI的检测，建议对急性医院获得性腹泻患者，特别是近3个月内曾经接受过抗菌药物治疗者送检粪便标本，一旦确诊应立即隔离诊治，并合理应用抗菌药物，严格掌握适应证，避免盲目使用广谱抗菌药物对于降低艰难梭菌感染的发病和传播亦极为重要。

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