PAB—Gal4—DBD—HA—Twist重组质粒的制备

张志霞　刘萍　何涛

【摘要】 目的：构建人Twist基因的表达载体pAB-Gal4-DBD-HA-Twist，为研究其转录调控机制提供实验工具。方法：重组克隆质粒pcDNA-Flag-Twist用含有特异BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的引物进行聚合酶链反应；对含有两种酶切位点的目的Twist基因片段和pAB-Gal4-DBD-HA载体进行酶切、分离、回收纯化、连接后转入感受态DH5α中，细菌培养，菌落聚合酶链反应、测序鉴定。结果：鉴定结果显示，Twist基因正确克隆到PAB-Gal4-DBD-HA表达载体，并且转入了大肠杆菌中。结论：成功构建了人twist基因PAB-Gal4-DBD-HA-Twist表达载体，为进一步研究其表达、调控、作用机制奠定基础。

【关键词】 转录因子； Twist； 基因克隆； 重组质粒

【Abstract】 Objective：To construct PAB-Gal4-DBD-HA-twist recombinant expression plasmid，providing experimental tools to study the transcription regulation.Method：The recombinant plasmid pcDNA-Flag-Twist was detected by polymerase chain reaction （PCR） using primers containing specific BamHⅠ and Hind Ⅲ restriction enzyme site.For the purpose of the Twist gene and pAB-Gal4-DBD-HA vector containing two kinds of enzyme cutting sites were studied by enzyme digestion，separation，recovery and purification，connected and transformed into competent DH5 alpha，they were detected by bacterial culture，colony polymerase chain reaction and sequencing identification.Result：The identification results showed that the twist gene recombinant plasmid was successfully constructed and transformed in E.coli.Conclusion：Full-length twist is subcloned into pAB-Gal4-DBD-HA vector successfully，and lay the foundation to further study its expression，regulation and mechanism.

【Key words】 Transcriptional factor； Twist； Gene cloning； Recombinant plasmid

First-authors address：Zaozhuang Vocational College，Zaozhuang 277800，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.009

TWIST蛋白是一种新近发现的转录因子，在胚胎发育中起关键调控作用[1]。随后的研究发现，其能与靶基因上的特异DNA序列结合，广泛参与调控器官生长发育、细胞的凋亡、肿瘤发生、细胞增殖分化等过程[2]。Twist基因是一个候选癌基因，能通过干扰p53相关的通路、抑制p21wafl、干扰NF-KB通路、直接抑制p65，干扰NF-KB的转录激活作用等多种途径抑制细胞凋亡[3-8]。Sosic等[7]研究发现，在生理情况下，TWIST蛋白不但在胚胎发育上扮演重要的角色，而且可以通过活化NF-kB途径抑制细胞因刺激而产生更多的细胞因子而造成对细胞的损伤[1]。同时，此基因的高表达可以使E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达缺失，促进间质-上皮转变（MET）而使恶性肿瘤获得或浸润、转移力增强[2]。由此可见，对于twist基因转录调控作用的研究是揭示其众多生理、病理功能的重要基础。目前，研究基因调控功能的方法之一就是构建待研究基因的表达载体。利用此研究思路，笔者尝试构建含有twist基因与Gal4-DNA结合区序列的PAB-Gal4-DBD-HA-Twist表达载体，来研究此基因表达调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料 pcDNA-Flag-twist和pAB-Gal4-DBD-HA由美国贝勒医学院徐建明博士赠予；DH5α由泸州医学院医学分子生物学实验室保存。BamHⅠ和HindⅢ、DNA mark（DL2000、100 bp DNA Ladder）、TaKaRa LA Taq with GC Buffer PCR试剂盒、质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公司；T4 DNA连接酶购自普洛麦格（北京）生物技术公司；溴化乙锭（EB）购自Sigma公司，酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂糖购自上海生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因扩增

1.2.1.1 带有酶切位点BamHⅠ和Hind Ⅲ的TWIST基因片段的获得 （1）扩增模版：pcDNA-Flag-Twist质粒。（2）引物设计：上游引物P1：5-GTTGGATCCAATGATGCAGGACGTGTCC-3；下游引物P2：5-TTAAAGCTTGTGGGACGCGGACATGGA-3。P1中GTT为保护碱基，GGATCC为BamHⅠ酶切位点，P2中TTA为保护碱基，AAGCTT为Hind Ⅲ酶切位点。扩增片段长度为650 bp（不含引入的酶切位点和保护碱基）。引物经BLAST分析，与Genebank数据库中其他基因没显著同源性，最后送上海生物工程有限公司合成。endprint

1.2.1.2 PCR扩增 反应体系：2×GCBufferⅠ 25 μL，dNTP mixture 8 μL，引物P1和P2各1 μL，TaKaRa LA Taq 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。在PCR扩增仪上进行反应：94 ℃条件下进行预变性 1 min，然后按94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，反应30个循环后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%的琼脂糖凝胶电泳检测。凝胶回收目的条带。

1.2.2 重组表达载体的构建 PCR产物纯化后与质粒pAB-Gal4-DBD-HA用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ于37 ℃ 2 h分别进行双酶切，酶切产物经凝胶电泳后回收纯化，按照T4 DNA连接系统说明进行连接反应。反应体系如下：10×biolabs buffer 2 μL，Twist基因0.5μL，线性pAB-Gal4-DBD-HA 0.7 μL，T4连接酶0.5 μL，ddH2O 16.3 μL，总体系20 μL，将上述反应体系室温放置15 min。将连接产物通过热休克法转化至感受态DH5α，37 ℃150 rpm摇床复苏培养45 min。取菌液均匀涂布于含终浓度为50 μg/mL的氨苄青霉素LB琼脂板上，37 ℃恒温箱中倒置培养过夜。

1.2.3 重组体的筛选和鉴定

1.2.3.1 菌落PCR筛选重组体 随机挑取数个菌落，做好标记，菌落聚合酶链法筛选重组体，按上述体系和条件反应；根据结果，挑取阳性克隆的另半个菌落至LB培养液中，37 ℃培养过夜。

1.2.3.2 质粒的提取酶切鉴定 按照质粒的提取试剂盒提取质粒，进行双酶切鉴定。Twist基因通过BamHⅠ和HindⅢ酶切位点进入载体pAB-Gal4-DBD-HA，双酶切后将会有约4500 bp、650 bp两个大、小片段。酶切体系如下：10×NE buffer 1μL，10×BSA 1μL，pAB-Gal4-DBD-HA-Twist 3μL，BamH Ⅰ 0.25 ?L，Hind Ⅲ 0.25 μL，双蒸水 4.5μL。总反应体系为10 ?L，37 ℃培养孵育1 h。

1.2.3.3 测序鉴定 初步鉴定阳性的克隆质粒送上海生工进行序列测定。

2 结果

2.1 pcDNA-Flag-Twist质粒PCR扩增结果 以pcDNA-Flag-Twist为模板，用特异性引物经聚合酶链扩增后，电泳检测为大小约650 bp的片段，与目的片段大小相符（图1）。

2.2 菌落PCR法鉴定pAB-Gal4-DBD-HA-Twist结果 pAB-Gal4-DBD-HA-Twist连接产物转化至DH5α，菌落PCR法扩增表达质粒，经凝胶电泳之后，结果与预期结果一致（图2）。

2.3 重组表达载体的双酶切鉴定 构建的pAB-Gal4-DBD-HA-Twist用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后出现两条片段，分别为pAB-Gal4-DBD-HA载体和twist片段，可初步鉴定此克隆为阳性（图3）。

2.4 表达质粒pAB-Gal4-DBD-HA-Twist测序结果与分析 初步鉴定为阳性克隆的pAB-Gal4-DBD-HA-Twist送上海生工公司测序，结果分析显示，重组质粒中的twist基因序列与基因库中公布的已知序列（NM_000474）完全匹配（图4）。表明目的基因序列按照预期方式定向插入表达载体，成功构建了重组表达载体。

3 讨论

Twist基因首先在果蝇中被发现，随后相继在其他脊椎动物中发现，脊椎动物的twist基因具有84%～100%的同源性[9-10]。其在幼稚中胚层细胞和中胚层起源器官中表达最多，而在出生后降至低水平，广泛参与众多生理、病理过程，它的信号通路是一个复杂、多途径的网络系统，是多种与肿瘤发生发展相关途径的中心环节[1，7，11]。Twist基因的转录水平与肿瘤的恶性程度、临床病理分期分级和转移能力有关，Twist基因促进了EMT的进程，增加了恶性肿瘤的转移与侵袭力，其上调表达与紫杉醇和/或长春新碱的耐药性有关[2，11-13]。

在本研究中，笔者采用HA作为目的基因的连接蛋白，其不会干扰标记蛋白的正常功能，而且可以任意加到目标蛋白的C-或N-末端。含有twist与Gal4-DNA结合区序列融合形成嵌合基因的重组表达质粒构建路线如图5所示。该质粒可以在细胞内表达出TWIST-Gal4-DBD融合蛋白，利用该蛋白的Gal4-DBD可以与报告基因的启动子结合的特性，使TWIST蛋白能够结合于报告基因的附近，对下游靶基因发挥转录调控作用。pAB-Gal4-DBD-HA具有很强的复制能力，可以满足宿主细胞分裂时跟随胞浆稳定的遗传给子代细胞，保证了目的基因的表达，此载体还含有高效SV40增强子，能顺式调控基因转录活性。

因此，该重组质粒的成功构建可以用于在活细胞自然状态下观察Twist的基因表达功能，为后续的其功能和临床的研究奠定了实验基础。

参考文献

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（收稿日期：2014-04-04） （本文编辑：欧丽）endprint

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