应用real—timePCR定量检测土壤中小麦纹枯病菌方法的建立

徐娜娜　李鹏昌　于金凤

摘要：根据小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis AG-D融合群ITS区的DNA序列设计特异性引物对WKF-8/WKR-8， 对引物的特异性和灵敏性进行检测，建立并优化基于SYBR GreenⅠ荧光染料法的real-time PCR 反应体系，绘制标准曲线。检测范围在1.0×10-3～10 ng/μl之间有良好的线性关系，相关系数R2为0.995，扩增效率为99.7%，灵敏度比常规PCR 方法高100倍。结果表明，该方法具有快速、特异性强、敏感度高等特点。

关键词：小麦纹枯病菌；SYBR GreenⅠ荧光染色法；real-time PCR

中图分类号：S435.12：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0106-04

AbstractA pair of specific primers， WKF-8/WKR-8， were designed according to the DNA sequence of the internal transcribed spacers （ITS） region of Rhizoctonia cerealis AG-D fusion group. Their specificity and sensitivity were detected. A real-time polymerase chain reaction system was developed and optimized based on SYBR GreenⅠfluorescent staining method. And the standard curve was drawn. A good linear relationship between the template DNA amount and cycle threshold （Ct） value was observed in the range of 1.0×10-3～10 ng/μl. The correlation coefficient was 0.995， and the amplification efficiency was 99.7%. The sensitivity was 100 times higher than that of conventional PCR. The results showed that this method had characteristics of speediness， high sensitivity and specificity.

Key wordsRhizoctonia cerealis； SYBR Green Ⅰ fluorescent staining method； Real-time PCR

小麦在国家粮食安全和农业现代化发展中占有重要地位[1]。小麦纹枯病是世界范围内严重发生的小麦病害之一。我国于1973年发现小麦纹枯病，近年来，随着小麦品种、栽培制度、肥水条件等的改变，纹枯病发生危害逐渐加重，已成为影响小麦高产、稳产的重大障碍[2]。陈莹、贾廷祥等的研究表明我国小麦纹枯病的优势致病群为AG-D融合群[3，4]。综合考虑和分析灾害对小麦产量的影响是小麦生产灾害诊断与预防的关键[5]。

目前对土壤中小麦纹枯病菌定量检测的方法主要是传统的活体分离、培养获得菌株或者使用土壤浸出液涂板，促使土壤中的病原菌形成肉眼可见的单菌落，从而估计出土壤中禾谷丝核菌的量。传统检测方法受人为影响大，可重复性低，难以实现标准化检测。近年来分子生物学的快速发展使得对病害的早期快速检测成为可能，并开始应用于纹枯病菌的早期诊断。张廷婷[6]于2012年采用荧光定量PCR 技术检测了花生种皮抗黄曲霉基因表达强度。Lees等[7]采用real-time PCR的方法，利用特异性引物对土壤中马铃薯黑痣病菌AG-3融合群进行了定量检测。Sayler和Yang[8]也从感病水稻植株上，定量检测了水稻纹枯病菌AG1-IA融合群。方正[9]用两对特异性引物从感染小麦纹枯病菌的植株茎基部DNA中扩增到了约480 bp的特异性分子片段，可用于对小麦纹枯病的早期快速诊断和对病害的监测和预测预报。

本研究通过比较普通PCR和real-time PCR方法在检测小麦纹枯病方面的优缺点，试图建立土壤中小麦纹枯病菌的real-time PCR方法，以定量测定土壤中小麦纹枯病菌自然潜育状态下的侵染量，为该病害的早期预测和防治措施的制定提供依据。

1材料与方法

1.1供试材料

小麦纹枯病菌相关菌株分离于山东农业大学小麦试验基地罹病组织，玉米纹枯病菌、棉花立枯病菌、马铃薯黑痣病菌、镰刀菌、蠕孢菌菌株由本实验室提供。

1.2菌株DNA的提取与标准品制备

挑取目的菌株菌丝块于附有灭菌玻璃纸的PDA培养基培养7 d，刮取菌丝，采用CTAB法[10]提取小麦纹枯病菌、玉米纹枯病菌、棉花立枯病菌、马铃薯黑痣病菌以及引起小麦茎基腐病的镰刀菌和蠕孢菌的DNA。以小麦纹枯病菌WK-206菌株的DNA为标准样品进行梯度稀释（1.0×10-6～1.0×102 ng/μl）。

1.3引物设计合成

小麦纹枯病菌DNA经克隆测序，获得ITS区序列。基于ITS区序列，利用引物设计软件DNAman和Primer 5设计小麦纹枯病菌的特异性引物对WKF-8/WKR-8，由上海生工生物工程有限公司合成，并通过常规PCR和real-time PCR对引物的特异性进行检测。

目前，对于土壤中小麦纹枯病菌的研究方法主要是微生物纯培养法，获得病原菌群落丰富的多样性。然而随着人们对土壤中微生物的原位生存状态研究，发现常规分离培养方法难以实现病原菌的动态监测[13]。新兴的实时荧光定量PCR 技术可以同时对多个样品进行分析检测，具有操作简便、快速高效，且高度敏感性等特点[14]，因此适合于检测环境中微生物在时间和空间上的动态变化。endprint

本研究根据real-time PCR的特点，基于ITS区设计了一对针对小麦纹枯病菌的特异性引物，特异性检测结果良好，使用最优化的real-time PCR体系建立标准曲线，检测待测样品。标准曲线的决定系数R2为0.995，完全适用于对该菌的定量检测，最低检测下限是1.0×10-5 ng/μl，比常规PCR高出100倍，结果稳定可靠。该方法特异性强、灵敏度高、检测迅速，能很好地用于土壤中小麦纹枯病菌的定量检测，对掌握病害发生发展及流行以及指导病害预测预报具有重要意义。

参考文献：

[1]王东， 鞠正春. 山东小麦生产发展潜力分析 [J]. 山东农业科学， 2013，45（12）：99-102.

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[6]张廷婷， 李春娟， 闫彩霞，等. 荧光定量PCR技术检测花生种皮抗黄曲霉基因表达强度 [J]. 山东农业科学， 2012， 44（5）： 9-13.

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本研究根据real-time PCR的特点，基于ITS区设计了一对针对小麦纹枯病菌的特异性引物，特异性检测结果良好，使用最优化的real-time PCR体系建立标准曲线，检测待测样品。标准曲线的决定系数R2为0.995，完全适用于对该菌的定量检测，最低检测下限是1.0×10-5 ng/μl，比常规PCR高出100倍，结果稳定可靠。该方法特异性强、灵敏度高、检测迅速，能很好地用于土壤中小麦纹枯病菌的定量检测，对掌握病害发生发展及流行以及指导病害预测预报具有重要意义。

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