磷霉素钙口服制剂有关物质测定方法的建立

刘雪峰，樊宝娟，王小亮，曾爱国，常 春，傅 强*(.西安交通大学药学院，西安 7006；.陕西省食品药品检验所，西安 70065)

磷霉素最早是由西班牙CEPA公司的Hendin等从费氏链霉菌发酵液中分离得到的一种广谱抗生素。本品的抗菌谱较广，对大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌均有一定的抗菌作用[1-4]。临床上主要用于肠道感染、泌尿系统感染、皮肤科及软组织感染及呼吸道感染等。常用的口服制剂为磷霉素钙片、磷霉素钙胶囊和磷霉素钙颗粒。

《中国药典》2010年版二部未对磷霉素钙口服制剂中的杂质进行控制，仅在磷霉素钙原料中采用滴定方法对磷霉素二醇物进行控制[5]，而对其有关物质的检查，采用专属性较强的方法很少见报道。本文建立了HPLC-ELSD方法对磷霉素钙口服制剂中杂质进行控制，并对磷霉素二醇物进行了LC/MS定性，采用自身对照方法进行定量，所建立的方法专属性强，准确无干扰，为更好地控制产品质量提供了有效的检测方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 Alliance HT型高效液相色谱仪，Attoch 3300蒸发光检测器，Empower工作软件；赛多利斯BP211D型电子分析天平，精度为0.01 mg。

1.2试药 样品：磷霉素钙片(不同生产企业提供的样品共11批)；磷霉素钙胶囊(不同生产企业提供的样品共34批)；磷霉素钙颗粒(不同生产企业提供的样品共6批)；磷霉素钙对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号0351-200001)；甲醇、乙腈为色谱纯，购自Merck公司；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1色谱条件与系统适用性实验 色谱柱采用Apllo C18(250 mm×4.60 mm，5 μm)；以5 mmol·L-1正辛胺(用醋酸调pH4.8)-乙腈(90∶10)为流动相；流速为0.8 mL·min-1；用蒸发光检测器检测(参考条件:漂移管温度60 ℃；载气流速为2.0 L·min-1)。理论板数按磷霉素峰计算应不低于2 000。磷霉素主峰与其相邻的杂质峰分离度应不低于2.0。

2.2系统适用性溶液制备 取磷霉素钙对照品适量，用5 mmol·L-1正辛胺溶液(用醋酸调pH3.5)制成1 mL约含磷霉素1 mg的溶液，水浴90 ℃加热10 min，放冷至室温，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪中，色谱图中磷霉素主峰面积与相邻杂质峰的分离度应不小于2.0。见图1。

图1 系统适用性色谱图

2.3供试品溶液制备 取装量或质量差异项下的供试品，研细，精密称取适量，用水制成1 mL约含磷霉素1 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.4自身对照溶液制备 取上述磷霉素供试品溶液，加水制成1 mL约含磷霉素25，50和100 μg的溶液，作为对照品溶液(1)，(2)和(3)。

2.5测定方法 精密吸取空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，按自身对照外标法以峰面积的对数与质量浓度呈线性关系计算杂质含量。不同剂型检测结果见图2。

2.6溶液稳定性实验 取磷霉素钙对照品适量，用水制成1 mL约含磷霉素25，50和100 μg的溶液，分别测定其室温放置0，0.5，1，2，4，8和12 h的主峰峰面积，其RSD分别为1.22%，0.94%和0.91%。说明样品溶液在12 h内较为稳定。

图2 不同剂型有关物质色谱图

3 方法学考察

3.1破坏性实验

3.1.1水溶液中高温破坏性实验 精密称取磷霉素钙原料药适量，加水制成1 mL约含磷霉素1 mg的溶液，作为供试品溶液。将供试品溶液于90 ℃水浴中分别加热1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分别取对照品溶液(1)，(2)和(3)和供试品溶液各时间段破坏的溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，供试品溶液色谱图中如有降解产物，降解产物峰面积和对照品溶液色谱峰面积按外标法峰面积的对数与质量浓度成正比关系计算含量。结果见表1。

3.1.2强酸溶液中高温破坏性实验 精密称取磷霉素钙原料药适量，用5 mmol·L-1正辛胺溶液(用醋酸调pH3.5)制成1 mL约含磷霉素1 mg的溶液，作为供试品溶液。将供试品溶液于90 ℃水浴中分别加热1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分别取对照品溶液(1)，(2)和(3)和供试品溶液各时间段破坏的溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，供试品溶液色谱图中如有降解产物，降解产物峰面积和对照品溶液色谱峰面积按外标法峰面积的对数与质量浓度成正比关系计算含量。结果见表1。

3.1.3强碱溶液中破坏性实验 精密称取磷霉素钙原料药适量，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液制成1 mL约含磷霉素1 mg的溶液，作为供试品溶液。将供试品溶液于60 ℃水浴中分别加热1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分别取对照品溶液(1)，(2)和(3)和供试品溶液各时间段破坏的溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，供试品溶液色谱图中如有降解产物，降解产物峰面积和对照品溶液色谱峰面积按外标法峰面积的对数与质量浓度成正比关系计算含量。结果见表1。

3.2检出限和定量限 将磷霉素钙对照品水溶液进行适当稀释后制得一系列不同质量浓度的溶液，进行分析，以S/N=3作为检测限，S/N=10作为定量限，结果磷霉素钙检测限为6.82 ng，定量限为10.23 ng。

3.3线性关系考察 取磷霉素钙对照品适量，加水制成1 mL约含磷霉素20.2，40.4，60.6，80.8和 121.2 μg的溶液，分别取10 μL，注入高效液相色谱仪中，以质量浓度为横坐标、色谱峰面积的对数为纵坐标，绘制标准曲线，结果回归方程：Y=47.686X+0.226 4，r=0.999 2。

3.4加样回收率实验 精密称取已知含量的磷霉素钙胶囊、磷霉素钙片和磷霉素钙颗粒各9份(约相当于磷霉素7.5 mg)，分别精密加入磷霉素对照品约4.5，7.5和10.5 mg，置于100 mL量瓶中，加水适量超声溶解并稀释到刻度，摇匀，制成相对含量分别为80%，100%和120%的溶液各3份，分别取10 μL，注入高效液相色谱仪中，计算回收率，结果磷霉素钙胶囊平均回收率为98.7%，RSD为0.98%，磷霉素钙片平均回收率为96.8%，RSD为1.14%，磷霉素钙颗粒平均回收率为93.6%，RSD为1.65%。

表1 不同时间破坏性实验结果

3.5精密度实验 取磷霉素钙对照品适量，用水制成1 mL约含磷霉素25，50和100 μg的溶液，分别连续进样6次，测定色谱主峰峰面积，其RSD分别为0.89%，0.57%和0.36%。

3.6专属性实验 取磷霉素钙系统适用性溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，收集主峰相对保留时间0.73处的杂质注入质谱检测器中[6]，结果其m/z153.9，判断其结构为磷霉素二醇物。其一阶质谱图见图3。

图3 磷霉素钙系统适用性溶液降解产物一阶质谱图

4 样品的测定

对全国磷霉素钙片、磷霉素钙胶囊以及磷霉素钙颗粒共计51批次样品进行了测定，结果均检出磷霉素二醇物，其中磷霉素钙片中磷霉素二醇物含量为0.95%～4.25%，磷霉素钙胶囊中磷霉素二醇物含量为0.45%～1.33%，磷霉素钙颗粒中磷霉素二醇物含量为1.91%～4.52%。

5 结果与讨论

磷霉素钙的水溶液和pH 3.5的5 mmol·L-1的正辛胺溶液在高温下都会降解，同时，降解产物的量随着时间的变化而变化。其中磷霉素钙的pH 3.5的5 mmol·L-1的正辛胺溶液在高温破坏下，降解产物的量随着时间的增长而增大，在4 h内，降解速率较大，之后随着加热破坏时间的增长，降解物的量逐渐缓慢增大。

由于不同的蒸发光检测器其温度和气体流速不尽相同，因此应根据不同品牌的蒸发光检测器进行适当调节，以满足检测条件。

本文采用HPLC-ELSD方法所建立的色谱条件，不仅可以测定磷霉素钙及其口服制剂有关物质的含量，而且对其测定含量具有很好的指导意义。该方法检测灵敏度高，分析时间短，分离效果好，结果准确可靠，可有效地控制磷霉素钙及其制剂的质量。

参考文献：

[1] 杨美成，刘浩，陈桂良，等.用离子对-HPLC法测定磷霉素钙及其有关物质的含量[J].药学服务与研究，2007，7(5): 343-345.

[2] 衷红梅，宋燕玲，席志芳.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定磷霉素钙胶囊含量[J].中国抗生素杂志，2006，31(4): 51-55.

[3] 衷红梅，宋燕玲，杨欣．高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定注射用磷霉素钠含量[J].药物分析杂志，2006，26(11): 1678-1680.

[4] 王嫦鹤，焦艳，杜珊，等.HPLC法测定乌拉地尔不同制剂中的有关物质[J].西北药学杂志，2013，28(3): 254-257.

[5] 国家药典委员会．中国药典2010年版[S].二部．北京：中国医药科技出版社，2010: 1167-1168.

[6] 刘畅，凌文婷，刘浩．液相色谱-电喷雾离子阱质谱法分析磷霉素氨丁三醇及其有关物质[J].药物分析杂志，2009，29(12): 2081-2084.