桔梗中总黄酮的提取工艺优化

谭玲玲，王 忠，胡正海(.青岛农业大学生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室， 青岛 26609；2.西北大学生命科学学院， 西安 70069)

桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.) A.DC.)为桔梗科(Campanulaceae)桔梗属(Platycodon)多年生草本植物，是一种兼有食用、药用、观赏价值的植物，其药用部位为根[1]。《神农本草经》中已记载：桔梗性平，味苦、辛[2]，有止咳、祛痰、宣肺、排脓等作用[3]。近年来，国内外学者对桔梗的化学成分、药理作用及临床应用等各方面进行了深入研究。研究表明，桔梗含有多种化学成分，其主要药用成分为总皂苷，还含有黄酮类化合物、多糖及脂肪酸等。其中的黄酮类化合物具有广泛的生物活性，如增强心血管系统活性、抗菌及抗病毒活性、抗肿瘤活性及抗氧化自由基活性等[4]。因此，本实验利用超声波，以乙醇作为提取溶剂对桔梗中总黄酮的提取工艺进行了研究。实验以总黄酮含量为指标，采用正交实验，考察了乙醇体积分数、超声时间及超声次数对总黄酮得率的影响。以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法，在510 nm处测定提取液的吸光度，计算、比较总黄酮的提取效果，筛选出提取桔梗总黄酮的最佳提取条件，为桔梗药材的进一步开发利用提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 AR1530电子天平(美国奥豪斯仪器(上海)有限公司)；KQ-3200DB型超声提取仪(昆山市超声仪器有限公司)；菲恰尔GL-16A型离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)；XMTD-2MA型电热恒温水浴箱(龙口市先科仪器公司)；UNICO UV-2000型紫外可见光分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)。

1.2试药 实验用桔梗采自山东省淄博市博山区池上镇，经青岛农业大学初庆刚教授鉴定为桔梗科桔梗属植物桔梗。选取健康植株的根、茎、叶，烘干、粉碎，过40目筛。样品测定前经60℃ 烘干15 h，取出，置于干燥器中冷却至室温备用。

芦丁对照品购自成都思科华生物技术有限公司(质量分数>98%)；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1因素及水平考察 根据桔梗总黄酮的理化性质，选取乙醇体积分数(A)、超声时间(B)和超声次数(C)3个因素，每个因素选择3个水平，设定因素水平表，见表1。

表1 正交实验因素水平表

2.2桔梗总黄酮的测定

2.2.1对照品溶液配制 精密称取芦丁对照品7.26 mg，置于50 mL量瓶中，加入体积分数70%乙醇，在沸水中溶解后，再用体积分数70%乙醇定容至刻度，摇匀，即得0.145 2 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2标准曲线的绘制 精确量取0.145 2 mg·mL-1的对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分别置于50 mL量瓶中，分别加入体积分数70%乙醇5.0，4.0，3.0，2.0，1.0和0 mL，再加入50 g·L-1亚硝酸钠溶液0.7 mL，摇匀，静置6 min；再加入100 g·L-1硝酸铝溶液0.7 mL，摇匀，静置6 min；再加入40 g·L-1氢氧化钠溶液5 mL，摇匀。最后用体积分数70%乙醇定容，30～40 ℃水浴箱中显色15 min。以试剂空白作为对照，在510 nm处分别测定其吸光度。以吸光度为横坐标、以对照品质量浓度(μg·mL-1)为纵坐标，得到回归方程为Y=67.357X+0.182 5(r=0.998 8)，结果表明，芦丁质量浓度在2.904～14.52 μg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.3精密度实验 精确吸取质量浓度为0.145 2 mg·mL-1的芦丁对照溶液2.0 mL，6份，具体操作见2.2.2标准曲线的绘制，分别测定6次吸光度。RSD为1.25%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.2.4桔梗总黄酮样品的提取 准确称取样品2.0 g，置于离心管中，将一定体积分数的乙醇作为提取溶剂，置于超声仪中超声一定时间。超声完毕后，在4 ℃下离心20 min(转速为1200 r·min-1)。超声完成后，对提取液进行过滤，滤液置于50 mL量瓶中，以同样体积分数乙醇定容，摇匀。即为待测的样品提取液。

2.2.5样品含量测定 精密量取各样品提取液10 mL，按2.2.2标准曲线的绘制项下方法测定其吸光度值，依据标准曲线，计算样品中总黄酮的含量。

2.3正交实验及结果 选取乙醇体积分数、超声时间和超声次数3个水平为主要考察因素，以总黄酮吸光度为考察指标，采用L9(34)正交表进行实验，每组实验重复3次取平均值。正交实验方案中总黄酮的吸光度测定结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 L9(34)正交实验设计及结果

表3 方差分析结果

由表2可以确定，利用超声提取法提取桔梗中总黄酮的最佳条件为A3B3C3，即乙醇体积分数70%、超声时间50 min、超声次数3次，桔梗总黄酮的提取效果最好。根据极差R的大小，可以判断各因素对实验指标的影响主次。R值越大，表示对指标的影响越大。由表2分析可知，各因素对桔梗中总黄酮提取率的影响程度依次为C(超声次数)>A(乙醇体积分数)>B(超声时间)。

由表3可知，其中超声次数对桔梗中总黄酮的提取的影响显著(PC=0.036<0.05)；而乙醇体积分数(PA=0.105>0.05)和超声时间(PB=0.204>0.05)对桔梗中总黄酮的提取的影响不显著。

2.4最佳提取条件下桔梗根、茎、叶中总黄酮的含量 在最佳提取条件下，分别对桔梗根、茎、叶中的总黄酮的含量进行测定，结果表明，桔梗根、茎、叶中总黄酮的含量分别为0.027%，0.039%和0.26%。

3 讨论

本实验中使用超声波对桔梗营养器官中的总黄酮进行高效地提取，提取效果较好，并且采用紫外分光光度法测定桔梗中总黄酮的含量，方法简单可行，易于操作。通过正交实验方案对影响桔梗中总黄酮提取的因素(乙醇体积分数、超声时间、超声次数)进行了研究，并得到了最佳工艺条件为A3B3C3，即乙醇体积分数70%、超声时间50 min、超声次数3次，桔梗总黄酮的提取效果最好。该提取工艺具有操作简单、提取率高等优点，因此，可以作为提取桔梗中总黄酮的优选方法。

同时，利用最佳实验条件对桔梗根、茎、叶中总黄酮的含量进行了测定，结果表明，桔梗中总黄酮主要集中在叶中。结果提示我们对桔梗中总黄酮物质的开发利用应重点选择叶片。这与谭玲玲[5]等对狭叶柴胡、王孟歌[6]等对山楂及李文芳[7]等对甘薯中总黄酮含量的研究结果相一致。在上述这些植物中，总黄酮均主要集中在叶中。目前，含有黄酮类化合物的植物虽然分布较为广泛，但是受到资源、产量、栽培条件等因素的限制，不能广泛获取原材料[8]。从传统的中药学方面来看，桔梗和狭叶柴胡入药的主要是根，山楂入药的主要是果实，甘薯入药的则是块茎，一般很少会用到叶子。目前，这些植物的叶子基本上是作为废弃物被丢弃，如果能利用现代科学技术，对桔梗、狭叶柴胡、山楂、甘薯等植物的药用部分采收时，采摘其叶进行深加工，从中提取黄酮类化合物，不仅能够变废为宝，而且有利于农民的增收，有着十分重大的经济和现实意义。

参考文献：

[1] 江苏新医学院.中药大词典[M].上海：上海科学技术出版社，1997: 289.

[2] 谭玲玲，彭化胜，胡正海. 桔梗的生物学特性及化学成分研究进展[J]. 南方农业学报， 2011，42(12)：1523-1527.

[3] 陆文总，杨亚丽，贾光锋，等.桔梗多糖对U-14宫颈癌抗肿瘤作用的研究[J].西北药学杂志，2013，28(1)：43-45.

[4] 武博，刘萍. 桔梗的现代研究进展[J].中国药物应用与监测，2008，5(2)：1-3.

[5] 谭玲玲，蔡霞，胡正海.狭叶柴胡中黄酮类化合物含量及其动态变化研究[J].南方农业学报，2012，43(2)：223-226.

[6] 王孟歌，田宝娟，乔凤霞.山楂叶中总黄酮含量的测定[J].光谱实验室，2006，23(4)：1-3.

[7] 李文芳，田春莲，黄美娥，等.甘薯叶和茎中黄酮类化合物含量的初步测定[J].中国农学通报，2005，21(4)：1-3.

[8] 李政浩，罗仓学.甘薯生产现状及其资源综合应用[J].陕西农业科学，2009(1): 75-77.