淀粉样脑血管病26例尸检标本免疫组化病理研究

李晓秋，周中和，徐慧琴，王耀山，陈会生

淀粉样脑血管病26例尸检标本免疫组化病理研究

李晓秋，周中和，徐慧琴，王耀山，陈会生

目的探讨 β 淀粉样蛋白(Aβ1-40、Aβ1-42)、β 淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein，βAPP)以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C，CC)在淀粉样脑血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)脑组织中的表达情况。方法 采用免疫组化方法，检测26例CAA患者尸检脑组织中Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP和CC的表达情况。结果 Aβ1-40表达广泛见于枕叶、颞叶、顶叶、额叶，Aβ1-42、βAPP表达可见于颞叶、枕叶和顶叶，CC表达仅见于1例顶叶和枕叶;Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP染色阳性主要见于中、小血管的血管壁外层，CC染色阳性多见于血管壁外膜，均可见脑血管壁增厚，透明样变性。结论 Aβ1-40是CAA血管壁内沉积淀粉样蛋白的主要成分，在CAA发生机制中起重要作用，并为CAA治疗目标Aβ从血管的靶向清除提供指导意义。

淀粉样脑血管病;淀粉样蛋白;半胱氨酸蛋白酶抑制剂C;淀粉样蛋白前体蛋白;脑出血;尸体解剖

淀粉样脑血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)是一种颅内微血管病变，以淀粉样物在软脑膜和皮层的小血管壁内沉积为主要病理特征［1-3］。CAA目前已成为老年人原发性、非外伤性、非高血压性脑出血的主要病因之一［4-5］，但其病因和发病机制尚未完全阐明，比较肯定的结果认为CAA致病基因表达的蛋白分别为β淀粉样蛋白前体蛋白(βamyloid precursor protein，βAPP)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C，CC)。已知超过10种不同的淀粉状蛋白可沉积在脑血管或脑实质［6］，最常见的为β淀粉样蛋白(amyloidβ，Aβ)。CC是沉积在血管内的除Aβ外的另一种淀粉样蛋白，目前认为CC在CAA相关脑出血淀粉样蛋白充载血管上更常见，严重CC沉积是CAA血肿扩大的重要危险因子。本研究采用免疫组化的方法，研究26例CAA患者尸检脑组织的淀粉样蛋白 Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP、CC的表达情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料 资料来源于我科1983—2013年245例脑尸解病例，逐一经HE、刚果红染色证实，发现26例CAA，男17例，女9例;年龄45～78岁，平均66.5岁。其中脑实质出血20例，蛛网膜下腔出血2例，出血性脑梗死、基底节区梗死、椎基底动脉闭塞及硬膜下血肿各1例。26例均符合 Boston CAA相关脑出血(CAAH)的诊断标准［7］，出血灶周围小血管壁刚果红染色阳性，无其他病理改变。

1.2 方法 切片脱蜡、抗原修复，染色步骤按PV-9000通用型二步法免疫组化试剂盒说明书进行，一抗分别为淀粉样蛋白 Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP、CC 多克隆抗体(均购自Sigama公司)。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 光学显微镜观察 以微小血管壁呈棕褐色为Aβ、CC蛋白染色阳性。每张切片在100倍光镜下对额叶、枕叶、颞叶、顶叶、壳核、小脑、海马4个随机视野内阳性微小血管进行观察。

2 结果

26例CAA脑组织Aβ1-40的表达广泛见于枕叶、颞叶、顶叶、额叶;Aβ1-42的表达以颞叶、顶叶、枕叶明显，额叶及其他部位染色阴性;βAPP的表达见于颞叶、枕叶、顶叶，其他部位染色阴性;CC的表达仅见于1例CAAH患者的顶叶、枕叶，其他病例、其他部位染色均为阴性。Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP 染色阳性主要见于中、小血管的血管壁外层，CC染色阳性多见于血管壁外膜，脑血管壁增厚，透明样变性。4种蛋白在顶叶脑组织中的表达情况见图1。图1 4种蛋白在顶叶脑组织中的表达情况 A.β淀粉样蛋白1-40表达(HE×100);B.β淀粉样蛋白前体蛋白表达(HE×100);C.β淀粉样蛋白1-42表达(HE×100);D.半胱氨酸蛋白酶抑制剂C表达(HE×40)

3 讨论

Aβ是由βAPP经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的包含39～43个氨基酸的多肽［8］。因酶切断部位不同，Aβ的C末端可出现长度不同的2种分子，即 Aβ1-40、Aβ1-42［9］。Aβ 凝集性高，以 β 折叠构造重合而形成纤维性凝集体，即β淀粉样蛋白，是散发性、年龄相关性CAA和阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)相关性CAA以及AD老年斑中淀粉样蛋白的主要组分。虽然Aβ1-40和Aβ1-42只有2个氨基酸的差异，但两者的生化特性显著不同，Aβ1-40为相对伸展的构象:无规卷曲，而Aβ1-42主要以比较紧密的构象:α2螺旋和β2片层构象存在。离体实验证实Aβ1-42较Aβ1-40有更高的纤维形成能力，而 Aβ1-40更容易聚集［10］。Aβ1-42 在淀粉样斑块的形成早期起重要作用，但是如果没有Aβ1-40的继续聚集，Aβ1-42本身无法形成成熟的、有毒性的斑块［11］。Aβ在脑脊液中通常稳定在800 ng/L左右，正常情况下Aβ从脑中的产生率和清除率分别为每小时7.6%和8.3%，清除量超过其产生量［12］。脑清除Aβ的机制包括:①血管途径:Aβ与载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)、α2M等蛋白结合后，通过血脑屏障低密度脂蛋白受体相关蛋白介导进入血液循环系统，维持脑中Aβ代谢平衡。绝大多数Aβ是经血脑屏障途径转运出脑。②胶质细胞途径:小胶质细胞和星形胶质细胞均可以吞噬Aβ。③酶解途径:目前至少有6种特殊的金属肽酶参与Aβ的生理降解，包括胰岛素降解酶(IDE)、肾胰岛素残基溶酶(NEP)、内皮素转化酶-1和2、金属基质蛋白酶-2和9、血管紧张素转化酶等［13］。这些酶能将Aβ降解为无毒性的小片段［14］。在基因敲除(敲除包括NEP在内的许多蛋白酶)小鼠实验中可观察到小鼠脑内源性Aβ增加。高表达NEP和IDE的小鼠模型脑内观察到Aβ水平下降和Aβ斑形成减少。Aβ在脑内沉积包括在脑实质沉积和沿小动脉沉积，前者包括弥散性斑块(周围无或有轻微的神经病理损伤)和致密的纤维状斑块(常伴有神经元营养障碍、炎症和神经元纤维缠结)。Aβ在细胞外沉积，即沿脑皮质和软脑膜的小和中等动脉以及脑微血管系统沉积，称为CAA［15］。弥散性斑块是在AD和Down＇s综合征患者脑中最早可见到的Aβ沉积［16］，大多数发生在神经细胞周围，有时呈大片“云状”，形成机制不清，可能缘于Aβ的自发性聚集，免疫组化研究表明斑块主要由N末端缩短的非纤维化Aβ1-42组成。弥散性斑块“成熟”后成为致密核斑块。近来研究表明，弥散性和致密核斑块在发生和生物化学方面均有不同，致密核斑块通常包括神经元营养障碍和炎症，因此又被称为“神经炎性”或“经典性”斑块［17］。致密核斑块含有较高的Aβ1-40，与血管壁内沉积的β淀粉样蛋白在成分和组织化学方面有相似性［18-19］。但也有研究表明，在大鼠海马内注射Aβ1-40可模拟AD患者的部分病理表现［20］。免疫组化研究表明，神经细胞内Aβ1-42沉积是AD患者和转基因APP小鼠Aβ沉积的最初形式，即可出现在细胞外斑块之前，也可在无细胞外斑块存在时出现。而且，细胞内Aβ与细胞外的Aβ池保持平衡，随疾病进展Aβ可从神经细胞内转移到细胞外(包括血管壁)［21-22］。

Obici等［23］研究发现导致严重CAA和致命性颅内出血的Aβ变异，即Aβ选择性在血管壁沉积，未见Aβ在脑实质沉积和神经元纤维缠结，其进一步遗传分析发现1个新的Aβ变异，βAPP的外显子17序列测定显示密码子705的第1个核苷酸从G到C易位。这一替换导致Aβ第34个残基上的亮氨酸被缬氨酸替换，因此显示出独特的神经病理学特性:Aβ选择性定位于血管壁内，所有切片均未见营养障碍性神经炎或神经元纤维缠结，所有患者均未携带与严重CAA相关的ε2等位基因。刚果红染色后在偏振光显微镜下可观察到特征性脑膜、大脑、小脑皮质、小和中等大小动脉壁中Aβ沉积的苹果绿双折光，并可见到严重CAA的病理特征，如“管内管”结构和继发的出血，以及继发性微血管变性的证据，如小动脉透明变性、微动脉瘤等。应用抗Aβ抗体进行免疫染色，提示Aβ1-40和Aβ1-42均存在。

小鼠转基因CAA模型为我们了解脑血管淀粉样变Aβ1-40和Aβ1-42的沉积提供了线索，转移试验证实Aβ具有潜在的从产生部位向外弥散的能力［24］。在单纯分泌 Aβ1-42的小鼠模型(如伦敦APP小鼠或BRI-Aβ42小鼠)上观察到神经元衍生的不可溶性 Aβ1-42肽被运输并沉积在血管壁上［25］。基于转基因小鼠模型(如APP23和Tg2576)的研究显示，血管淀粉样变是自发性脑出血(脑微量出血和致命性脑叶出血)的主要原因，且Aβ在血管壁沉积可导致血管壁平滑肌细胞和其他血管壁成分变性，另外，非淀粉样变血管也可见到超微结构的微血管功能异常，如内皮细胞丧失，基膜增厚和血管壁平滑肌细胞变性［26］。细胞转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)转基因小鼠实验结果显示，当毛细血管基膜增厚时，加速了 CAA形成［27］，提示基膜增厚可能是CAA发展的促进因素。

Aβ1-40是Tg2576和PSAPP小鼠脑中观察到的主要的Aβ肽，研究表明，Aβ1-40在CAA和致密核斑块形成中起重要作用，Aβ1-40急剧减少可引起CAA和致密核斑块形成大量减少，如APP T7141变异奥地利系谱中观察到的，Aβ1-40体外减少约80%，脑内几乎未见到Aβ1-40，同时未见到CAA和致密核斑块［28］。有研究表明，Aβ1-42 不仅对于Aβ1-40在脑实质沉积是必需的，而且对于Aβ1-40在血管内沉积也是必需的［25］。

本研究结果显示，Aβ1-40、Aβ1-42和 βAPP表达广泛见于枕叶、颞叶、顶叶、额叶脑膜及皮层，染色阳性主要见于中小血管的血管壁外层，同时可见脑实质和脑膜血管扩张，血管壁增厚，透明样变性。由此推测，Aβ1-40是CAA血管壁内可沉积的淀粉样蛋白的主要成分，在CAA发生机制中起重要作用，Aβ1-42、βAPP也可能参与了CAA的发生。

CC是冰岛型遗传性淀粉样变脑出血(HCHWAI)中沉积在血管壁内的除Aβ外的另一种淀粉样蛋白，由120个氨基酸残基组成，相对分子质量为13 260，在脑脊液中的含量是血浆中的5.5倍［29-30］。免疫组化研究发现，CAA脑出血患者脑内淀粉样沉积物中CC常与Aβ共存，也可以在无脑出血患者的淀粉样变微血管壁中找到，而且CC沉积继发于Aβ沉积。与无脑出血的CAA患者相比，CC在CAA相关脑出血(CAA-related hemorrhage，CAAH)患者淀粉样蛋白充载血管上更常见，但其作用并不清楚，可能在脑出血的发生发展中起一定作用［31］。

目前利用Aβ和CC的单克隆抗体定位CAA已成为诊断CAA相对敏感的方法［32］。CAA患者均可显示Aβ免疫活性，且Aβ和CC的协同定位有助于诊断CAA相关出血。散发性CAA血管壁除有Aβ沉积外，有时也可有CC沉积，但不表现为纤维状结构;冰岛型CAA只有CC免疫活性而无Aβ反应。有研究显示，严重CC沉积是CAA血肿增大的重要危险因子，并且在淀粉样物质沉积血管壁内可见到平滑肌细胞的丧失［33］。本研究结果显示，CC的表达仅见于1例多灶性大量脑出血，且染色阳性多位于血管壁外膜。提示CC的表达在国人散发性CAA中阳性率较低，也可能只见于CAA的亚型。

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Immunohistochem ical Study of 26 Autopsy Cases of Cerebral Amyloid Angiopathy

LIXiao-qiu，ZHOU Zhong-he，XU Hui-qin，WANG Yao-shan，CHEN Hui-sheng(Department of Neurology，General Hospital of Shenyang Military Area Command，Shenyang 110840，China)

ObjectiveTo evaluate the expressions of Aβ1-40，Aβ1-42，β-amyloid precursor protein(βAPP)and Cystatin C(CC)in the brain issues of cerebral amyloid angiopathy(CAA).MethodsExpressions of Aβ1-40，Aβ1-42，βAPP and CC in the brain samples of26 autopsy cases of CAA were detected by immunohistochemicalmethod.ResultsThe Aβ1-40 expression in vessel wallwidely existed in occipital，temporal，parietal and frontal lobes，expressions of Aβ1-42 and βAPPexisted in temporal，occipital and parietal lobes，and CC expression existed in parietal and occipital lobes of one case;positive stainings of Aβ1-40，Aβ1-42 and βAPPweremainly existed in themedium-sized and small-sized vascular outer layer of vesselwalls，positive staining of CCmainly existed in the outermembrane of the vessel walls.At the same time，thickening and hyaloid degeneration of cerebral vesselwallwere also found.ConclusionAβ1-40 is themain component of amyloid-laden vesselwalls，and it has important implications for the pathogenesis of CAA，whichmay provide therapy guidance for targeting Aβto be cleared from blood vessels.

Cerebral amyloid angiopathy;Amyloid;Cystatin C;Amyloid precursor protein;Cerebral hemorrhage;Autopsy

R743.9

A

2095-140X(2014)04-0020-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2014.04.006

辽宁省博士启动基金(20121088)

110840沈阳，沈阳军区总医院神经内科

陈会生，E-mail:chszh@aliyun.com

2013-11-18 修回时间:2013-12-27)

·论著·