天然水域中贝毒素及检测方法综述

马嵩，彭福，张天峰，陈葵

（1. 济南市水产技术推广站，山东济南 250021；2. 济南市淡水养殖科学研究所，山东济南 250000；3. 苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123）

序言

有害赤潮肆虐于我国和世界各国沿海，是国际社会共同关注的重大海洋环境问题和生态灾害。1998年至今，每年都发生了面积超过1000km的特大赤潮，其中有几年赤潮面积甚至达到上万平方公里；与此同时，有毒、有害的赤潮原因种也在不断增加，其中甲藻等有害种类已成为我国赤潮的主要原因种[1]。这些趋势充分表明了我国赤潮问题的严重性和复杂性。有些有害赤潮生物能产生毒素，经贝类或鱼类累积后危害食用者的健康和生命[2]，调查表明麻痹性贝毒和腹泻性贝毒这两类主要的藻毒素污染普遍存在于我国沿海，近年有记录的贝毒事件中，有几百人中毒，数十人死亡[3]。可以说水域生态中贝毒素问题已经是个值得引起高度重视的环境问题。

由毒藻产生的毒素往往经贝类、鱼类等传播媒介造成人类中毒，因而这类毒素通常被称为贝毒、鱼毒，而不是赤潮毒素或藻类毒素。贝类毒素主要分为5类：腹泻性贝毒DSP、麻痹性贝毒PSP、神经性贝毒NSP、记忆缺损性贝毒ASP、西加鱼类毒素CTX等。

1 腹泻性贝毒DSP

腹泻性贝毒DSP是首先从紫贻贝的肝胰腺中分离出来的一种结构复杂的生物活性物质，一般在食用后会产生以腹泻为主要特征。

在中国引发腹泻性贝毒的藻类有：渐尖鳍藻Dinophy sisacuminata、具尾鳍藻D.cuta、倒卵形鳍藻D.fortii、底层原甲藻Prorocentrum lima、D.mitra、D.novegica、和D.tropos等[4]。

腹泻性贝毒是一种脂溶性物质，其化学结构是聚醚或大环内酯化合物[5]。目前发现的腹泻性贝毒至少有12种，其中9种结构已经确定，分为3大类：大田软海绵酸OA，及其衍生物鳍藻毒素DTX-3；大环内酯贝毒素PTX-1、PTX-2、PTX-3、PTX-6；磺化毒物、紫夷贝毒素YTX及其衍生物。腹泻性贝毒主要作用于酶系统，为肿瘤促进剂，人食用后可引起多种不适反应，包括腹泻、恶心、呕吐等，目前尚无有效的治疗药物。腹泻性贝毒对人的最小中毒量为12-18MU。1MU相当于3.2μgDTX-1、DSP的毒性LD50为192μg/kg。三类腹泻性贝毒的毒理作用各有不同，大田软海绵酸（OA）对小鼠的腹腔注射的LD50为116×10-8g/g，会使小白鼠或其它动物腹泻，现已证明其是一种重要的癌症促进剂。鳍藻毒素-3只会引起腹泻，小白鼠LD50为5×10-8g/g。第二类大环内酯-扇贝毒素对小白鼠LD50为116×10-7-717×10-7g/g，作用是损伤肝。而磺化毒素及其衍生物的作用部位是心肌，对小白鼠的LD50为1×10-7g/g[6]。

因为DSP是一种潜在的毒物，在贝类中含量很少，因此测定方法需要十分灵敏可靠。在大多数贝样中OA是DSP的主要成分，所以检测方法也主要集中在OA上。主要方法有：

1.1 小白鼠分析法

小白鼠分析法属于国际上通用的常用检测方法。国内常规的检测也都用此方法[7]。该法由Yasumoto[6]等建立，具体方法是用丙酮提取样品中的毒素到乙醚中，减压缩蒸干后以1%的吐温-60生理盐水溶解残留物，腹腔注射小白鼠，观察其存活状况，计算毒性。此法方便快捷，故商检系统常使用此方法进行检测。计量单位是鼠单位（MU），鼠单位是由美国公职分析化学家协会AOAC定义[8]，一个鼠单位MU(相当于0.18μg)为给予20g小白鼠注射1ml贝类提取物使其在15min内致死的最小剂量。该方法在概括样品毒性方面相当有效，但也有较多的限制，如该法不能确定样品中毒素结构；毒素分子与受体亲和的错误率高±20%；该法是利用对小白鼠腹腔注射毒物测定其死亡时间以确定毒性大小，因此灵敏度低；该法在标准程序中不同小鼠的品系、批次、损伤程度和大小对毒素的灵敏度有很大的波动性；浪费较多的毒素和需使用活体动物等等。

1.2 免疫法

免疫法是利用抗原-抗体反应确定毒素类型及含量，包括ELISA、RIA、EIA及S-PIA法等。其中ELISA法中所采用的抗体仅与DTX21和OA反应，不与其他毒物反应，因此专一性较强，而且灵敏度可达10-9。用于毒素检测的免疫法为生物体外测试法，其敏感性要比相应的小白鼠生物法或HPLC法高得多，检测级可以达到pg级。

1.3 细胞毒性分析

1）测定鼠肝细胞经贝毒萃取物处理后的乳酸脱氢酶渗漏状况，该法尚不成熟，需进一步研究后方可用于毒性检测。

2）L1210鼠白血病细胞的生长抑制法：用血清培养L1210鼠白血病细胞，加入毒物萃取物，测定其细胞生长受抑制的情况，即可判断其毒性大小[9]。

1.4 毛细管电泳法

N.Bouaichan[10]首先用毛细管胶束电动电泳，紫外检测器检测贻贝中的OA与DTX22，但由于缓冲液等问题，效果不是十分理想。在此基础上，张基木[11]等用毛细管胶束电动色谱MEKC检测OA和DTX1，其检测限达到3.25μg/ml。由于电泳具有操作简单、快速等特点，有望成为贝毒检测的常规手段。

此外，还可以通过气相液相色谱[12]及液质联用法[13]等化学方法进行检测，在后面毒素检测中会有详细化学方法的介绍。关于腹泻性贝毒来说，现有的检测方法还各自存在不足。对于常规检测来说，免疫法是一种常规宜用方法，当条件具备时，可以将毛细管电泳法作为贝毒检测的常规手段。国外很多检测部门都已经开始使用此方法进行检测[14]，这将是腹泻性贝毒的检测的发展方向。

2 麻痹性贝毒PSP

麻痹性贝毒PSP是目前世界上分布最广事故发生频率最高的一种贝毒。PSP主要产自海洋中的单细胞甲藻，目前已经分离出20种毒素，依基因的相似性分为3类，石房蛤毒素STX、新石房蛤毒素neo-STX、膝沟藻毒素GTX。它们是以石房蛤毒素STX为骨架和取代基不同而衍生出的多种化合物组成[15]。由于多叠六元环基本结构衍生出的个别位置上基团的差别，其毒性也略有差别[16]。

PSP可以沿食物网进行传递、积累和代谢，结果不仅使直接营滤食生活的贝类、草食性鱼类等含毒，而且使许多更高营养级的生物染毒。人们发现有毒藻被双壳类如贻贝、蛤、牡蜘等滤食后，在胃、肠道内经消化吸收，其所蓄积的毒素成分可借由食物链传递至更高级的鱼、甲壳类（虾、蟹），甚至是哺乳类的体中[4]。近年来的野外及实验室研究还发现PSP可沿着浮游动物（挠足类、枝角类）转移至鱼苗中[5]，从而对鱼类的繁殖环节产生负面作用。仔细看来，海洋生态系统的各个营养级似乎都可见PSP毒素存在的影子。

麻痹性贝毒的毒理作用是神经肌肉麻痹剂，阻断细胞纳离子通道，造成神经系统传输障碍而生产麻痹作用。对人的中毒量为600～5000MU，致死量为300～3000MU，且目前没有对症解毒剂。PSP的LD50在3～10×10-9之间，其中石房蛤毒素是眼镜蛇毒素毒性的80倍，0.5mg足以使人致死。贝类摄入此毒素对本身无害，因毒素在贝类体内呈结合状态。当人食入后，毒素会迅速释放并呈现毒性作用，潜伏期仅数分钟或数小时，症状包括四肢肌肉麻痹、头痛恶心、流涎发烧、皮疹等，严重的会导致呼吸停止。

国内的麻痹性贝毒产生的原因种多为有毒甲藻塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense），所以研究的重点也在此藻种对海洋生物的相关影响方面。已知的有对黑褐新糠虾（Neomysis awatschensis）的存活、生殖、生长等有不利影响，影响程度随藻细胞密度的增加而增加。在96h急性毒性实验中，塔玛亚历山大藻对黑褐新糠虾的半致死密度为7000个/mL，去藻过滤液中糠虾的死亡率为25%。在62d的慢性毒性实验中，藻密度900个/mL条件下对黑褐新糠虾的繁殖产生严重影响[17]。颜天等[18]证实塔玛亚历山大藻对鲈鱼（Lateolabrax japonicus）幼鱼（2.5cm）的存活有明显的影响，96h的半致死浓度为4000个/mL。传统的观点认为毒素对贝类本身没有影响，贝类只是起中间媒介的作用。但80年代以后的研究表明，有毒藻能够影响贝类，影响的大小与贝的种类以及以往是否接触过有毒藻有关[19]。傅萌等发现塔玛亚历山大藻能抑制墨西哥湾扇贝早期D形幼虫的游泳能力，对D形幼虫的生长产生影响，使长成的稚贝个体较小，而且它还能抑制仔贝的爬升附着能力。在对栉孔扇贝受精卵孵化影响的实验中发现，塔玛亚历山大藻能显著抑制栉孔扇贝受精卵的孵化。同时，对双壳类的受精卵和眼点幼虫等发育段也有影响[20]。周立红等研究了水中不同细胞密度塔玛亚历山大藻对菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）、翡翠贻（Perna viridis Linnaeus）鳃组织的Na，K-ATP酶活性的影响，结果显示低密度藻细胞对这些动物鳃组织Na，K-ATP酶有激活作用，高密度则有抑制作用[21]。

鉴于PSP的毒力特点，在其监测方面，主要有下列方法：

2.1 高效液相色谱法（HPLC）方法

高效液相色谱法能对PSP的成分及毒力进行准确的分析和测定，主要有过柱氧化法[22]和柱前氧化法[23]，柱前氧化和过柱氧化的差别不仅是衍生化前后的分离对象不同，而且氧化手段也不同，柱后氧化比柱前氧化更有前途。此方法无论是谱图、灵敏度还是回收率都比较可取，但是标准样品的缺乏却妨碍这个方法的推广。而且柱后氧化法专一性强，要求设备较复杂，国内大多数实验室不能做到，且分析时间较长。柱前氧化法只能检测出贝体内的几种主要PSP毒素成分，普通的高效液相色谱仪就能完成。所以可以推广柱前氧化法作为作为生物法检测麻痹性毒素阳性样品的复检方法。高效液相色谱-串联质谱的检测方法目前已经由国内机构进行检测研究，取得良好效果，可以作为未来高效液相色谱检测发展方向[24]。

2.2 小鼠生物测定法

MBA作为PSP的半定性分析方法，被美国公职分析化学家协会AOAC推广为PSP的标准检测方法，同时也是唯一国际大多数国家普遍接受的统一方法。AOAC定义一个鼠单位MU（相当于0.18μg）为给予20g小白鼠注射1ml贝类提取物使其在15min内致死的最小剂量。该方法灵敏度低，其检出限约160ngSTX/m1贝肉；所以无法进行低毒量检验。

2.3 电泳技术

在PSP家族中，各种毒素分子所带电荷量不同，如STX、neoSTX、dc-neoSTX、d-STX等均带两个正电荷；GTX1～6、dc-GTX1～4、do-GTX2/3等均带一个正电荷；而C1～4都不带电荷。所带电荷量的差异可用电泳技术初步分离PSP，在醋酸纤维薄膜上涂氧化剂（如H2O2等）加热氧化。使毒素分子发生颜色反应，在紫外灯下检测。在多种电泳技术中，最常用的是毛细管电泳（Capillaryelec trophoresis, CE），主要用于分离测定PSP毒素中的非衍生毒素，如STX，neoSTX等，电泳峰常通过一个离子喷雾CE-MS接口用质谱仪检测。而串联的质谱分析技术可提供毒素分子的结构信息，以鉴定各异构复合物[25]。

2.4 免疫检测

根据抗原抗体反应，采用针对麻痹性贝毒毒素的抗体检测毒素，现在已经建立了放射免疫检测和酶联免疫检测等多种技术。免疫检测法具有方便、迅速的特点，缺点是价格高，且各毒素之间的交叉反应低，不能完全体现出样品的毒性。

2.5 细胞毒性测试检测方法

PSP毒素具有钠离子通道阻塞剂的特性。加拿大学者应用结晶紫对细胞进行染色的办法，减少了细胞用量，可以同时大量检测样品，灵敏度高，但缺点是操作繁琐。陈杰等对这些方法进行了改进，步骤简便，并且实验证明此拮抗或解救作用与PSP类毒素呈剂量反应关系[26]。

由于麻痹性贝毒和河豚毒在致毒机理上有很多相似之处，可以和河豚毒进行交互合并性检测。

3 神经性贝毒NSP

神经性贝毒NSP主要是从天然和培养的有毒赤潮生物——短裸甲藻（Crymnodinium breve）细胞提取液中分离出神经性贝毒毒素成分。因贝类摄食短裸甲藻后在体内蓄积，被人类食用后产生以神经麻痹为主要特征的中毒。从短裸甲藻细胞提取液中分别分离出神经性贝毒共计13种，其中11种成分结构已经确定。

NSP主要通过两种途径对人体造成危害。一种途径是由食用受短裸甲藻赤潮污染的贝类或含有短裸甲藻分泌毒素的贝类引起的人体神经性中毒。神经性中毒症状有：眩晕、头部神经机能失调、瞳孔放大、身体冷热无常、恶心、呕吐、腹泻；严重情况下，心律失常、感觉急性窒息。其中毒的潜伏期在30min～3h之间。中毒症状的持续时间，依据食用有毒贝类量的多少有所差异。通常在3～4d之间。据McFarren[27]报道，50～80MU的神经性贝毒毒素将使人体出现某些中毒症状；400～500MU的神经性贝毒将使人体出现中等程度的中毒症状。

另一种途径是与呼吸或接触了含有短裸甲藻细胞或其代谢物的海洋气溶胶颗粒有关的呼吸道中毒症状。主要中毒症状有气喘、干咳、流清鼻涕和刺激性结膜炎。其中毒症状可以持续数日。

NSP可以引起鱼类的大量死亡，但NSP的毒性总的来说较低，对小鼠的LD50为50g/kg。主要的检测方法有：

3.1 免疫法

Dr.Poli用RIA放射免疫分析法分析贝类提取液和NSP感染的病人尿液，发现4个主峰，其中一个峰经HPLC-MS鉴定是PbTX23，而另三个分析不出来的峰则是含量更高的NSP，Garth-waite[28]提出了一套针对NSP毒素的ELISA检测法，对于PbTX-3有检测限为0.53ng/ml，其优势是可以直接分析海水，而且有潜力作为鉴别有毒鞭毛藻的工具。Maucher[29]等1422采取EL1SA和最优血液收集卡法检测瓶鼻海豚沾染短裸甲藻毒素PbTx-3，用于监测赤潮发生时的短裸甲藻毒素存在情况。

3.2 液质联用LC-MS法

液质联用技术几乎可以分析所有的贝毒液质联用依赖于高效液相色谱把贝毒成份通过界面装置带到质谱中。有两种界面技术可用，一种是电喷雾电离ESI，另一种是大气压化学电离AP-CI，这两种技术都已经应用于贝毒分析。Hua YS[30]等用LC-MS（ESI）法，其检测限达到10pg。

3.3 高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱（HPLC/Q-TOFMS）

目前上海出入境检疫局利用高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱（HPLC/Q-TOFMS）联用技术对贝类样品中的PbTX22进行了检测[31]，由于Q-TOFMS具有高灵敏度、高选择性的特点，可以在极低的浓度下作全谱扫描，提供精确质量，因此可以对微量神经性贝毒PbTX22进行快速鉴别和测定，检测限达到0.5ng，回收率及精密度结果都令人满意。只是设备要求太高，不宜推广。

4 记忆缺损性贝毒ASP

赤潮毒素记忆缺损性贝毒ASP是由多列拟菱形藻p.seudonitzsehia分泌产生的毒素，直到1987年才被发现，其引起中毒的成份是软骨藻酸DA[32]，软骨藻酸最早是在日本鹿儿岛的大型藻类植物软骨藻（Chondria armata domoi）中分离出来的，并作为胃肠道的驱虫药使用[33,34]它是一种强烈的神经毒性非蛋白氨基酸，有七种异构体，由长链羽状硅藻代谢产生的一种物质，能导致短期记忆功能长久损害。

Lage等[35]的最新研究发现，在葡萄牙沿海的多列拟菱形藻生长期，在章鱼的食物（贝类）中未检测到软骨藻酸，而章鱼的消化腺中却检测到了软骨藻酸，可见软骨藻酸能通过贝类等的富集进入海洋生物的食物链中。经研究发现，软骨藻酸摄入量为15～20mg的人群未受其影响，摄入量为295mg时表现出各种严重症状，摄入量为60～110mg时会引起中度胃肠道症状，可见软骨藻酸的毒性具有剂量效应[34]。半致死量LD为10μg/50kg。在我国对ASP贝毒开始引起足够的重视和关注。

目前，ASP的分析方法主要有生物小鼠法、高效液相色谱法、毛细管电泳法[36]以及一些免疫化学方法。生物小鼠法优缺点前面已经在前面叙述过。高效液相色谱（HPLC）-紫外检测方法和HPLC-MS分析方法因其选择性和灵敏度高而被普遍认可。迄今为止，HPLC对贝毒素的分析应用最成功的是对软骨藻酸的分析。澳大利亚食品卫生标准法规将此法列为国标。为保证分析回收率，在样品处理时，应尽可能减少酸性溶液在空气中的暴露时间[37]。另外，还将液相色谱/四极杆-飞行时间质谱连用的测定法用于到ASP的测定，取得不错的效果[38]。但HPLC等仪器设备价格昂贵，样品的前处理操作复杂故而不易满足大批量样品的检测分析需要。近年来得到快速发展的ELISA方法[39,40]，以其特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速和分析成本低的优点被广泛应用于环境中污染物的分析。随着科技的发展，现有的多克隆抗体逐渐被特异性更好的单克隆抗体取代，单克隆抗体在ELISA方法的应用大大地提高了ELISA方法的特异性和灵敏度。Kawatsu等首次采用单克隆抗体制备技术，建立检测DA的间接竞争ELISA法，检测限低至0.15～10.00ng/ml[41]。国内方面，高利利等利用杂交瘤细胞融合技术成功制备了能稳定分泌抗软骨藻酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并通过体内诱生腹水并纯化后，得到效价为1∶64000的单克隆抗体，为进一步开发软骨藻酸快速检测ELISA试剂盒奠定基础[42]。

5 西加鱼毒素 CTX

西加鱼毒素CTX是深海藻类分泌的毒素，被热带或亚热带食草性鱼类蓄积并在鱼体内被氧化成的一类强毒性毒素[43]。主要的产毒藻是有毒岗比亚藻（Gambierdiscus toxicus），可分为脂溶性的西加毒素（Ciguatoxins, CTX）和黑儿茶（Gambiero1），水溶性的刺尾鱼毒素（Maitotoxin,MTX）和水媳毒素（Palytoxin）两大类[44]。其中主要致毒成分是西加鱼毒素CTX和刺尾鱼毒素MTX。西加鱼毒素是热稳定物质，中毒后能引起一系列胃肠道和神经系统症状，能够作用于钠离子通道位点并导致静息状态下钠离子通道打开，造成钠离子内流，与神经性贝毒的作用机制相似。而对神经性贝毒建立起来的免疫试剂能和西加鱼毒发生交叉反应，表明两种毒素之间存在相似的表位。主要毒性表现是神经功能失调，最著名的特征是“干冰的感觉”的热感颠倒。即当触摸热的东西会感觉凉，把手放入水中会有触电或摸干冰的感觉。CTX死亡率较低，但每年中毒者却高达数万人。CTX的LD50为0.45μg/kg；MTX是水溶性毒素，LD50为0.17μg/kg。有动物实验表面，CTX毒性是河豚毒TTX的100倍，是至今发现的分子量最大、毒性最强的自然产物。

检测西加鱼毒素可采用小鼠生物法、免疫法和HPLC法。其中免疫法由于西加鱼毒素的抗体和其他聚醚类物质的交叉反应以及抗体供应原因限制了其方法的广泛应用。HPLC方法是利用分子结构上的羟基与蒽羰化青反应生成荧光性物质，然后在FLD下检测，其检测限可达ng/kg级，线性较好。

总结

水域生态中的海洋毒素已经成为世界上海洋环境生态的研究热点，现在主要的检测方法主要是动物活体检测，免疫法以及高效液相色谱等检测方法。这些方法各自有其不足之处，都有待完善。随着科研的进一步深入，新的毒素不断被发现，毒素标准的获取也成为一个亟待解决的问题。我们需要更加深入研究，了解其完整的制毒原理，以达到对其控制并不断提高检测分析方法。使之更简便、更快速、更灵敏的进行贝毒检测，对其潜在的危害做出判断保障人类健康。并充分利用海洋毒素这种自然的产物造福人类。

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