口腔细胞采集卡DNA分型快速检验模式的建立

魏福军，张建，王天华田，田贾世友，伊莎莎，郭玉秋

（1. 大庆市公安（局南刑京事航技空术航支天队大，学黑 龙生江物大医庆学 工16程33系11，；江2. 苏公省安 部南物京证市鉴 21定00中16心），北京 100038）

近些年来， DNA数据库的建设和应用，极大提升了公安机关打击犯罪的效能。DNA数据库建设业已成为目前法庭科学领域发展的重中之重，DNA数据库的规模及内存容量也在逐年扩大[1,2]。当前，DNA数据库样本的检验主要包括样本采集、样本直接扩增、DNA检测三个主要步骤。样本采集主要是指各地公安机关对违法犯罪人员及相关涉案人员进行身份信息和相应生物样本采集。传统数据库样本主要以血卡为主，针对该类样本，各DNA实验室均已建立的成熟的DNA检验流程，检验成功率高、检验速度快。与此同时，近年来口腔细胞样本采集卡由于具备使用方法简单、被采集者无创无痛等特点，能够避免基层民警取样带来不必要的纠纷，因此，在有些地区口腔细胞样本采集卡正逐渐替代传统的血样采集。然而，该类样本的检验也存在一系列问题：第一，无法准确定位口腔细胞采集卡上口腔细胞的位置；第二，口腔细胞在采集卡上分布不均，存在着取样时取不到细胞造成初检成功率低的情况[3,4]。有鉴于此，目前口腔细胞的检验仍是一个比较棘手的问题，针对该类样本的检测主要还是以DNA自动化提取后再进行扩增检测的方法为主，这种方式费时、费力、同时耗费大量办案经费。本研究通过采用小孔径生物样本自动打孔仪多点取样的方式，结合DNATyperTM19试剂盒对口腔细胞样本进行直接扩增，初检成功率达到98%，极大提高了口腔细胞卡类样本的批量检验效率，解决了困扰法庭科学DNA实验室的口腔卡类数据库样本的检验难题。

1 材料与方法

1.1 试验样本

本实验室日常积累的违法犯罪人员口腔细胞采集卡样本（博坤公司研制）200份。

1.2 主要试剂

DNATyperTM19试剂盒（公安部物证鉴定中心，中国）。

1.3 主要仪器

BSD600型半自动打孔仪（BSD公司）、BIOMEK-NXP、BIOMEK-3000自动化工作站2台（贝克曼公司）、9700型扩增仪（AB公司）、3130XL型基因分析仪（AB公司）。

1.3 试验方法

1.3.1PCR反应液分装

按照DNATyperTM19试剂盒说明书配制PCR扩增试剂，利用BIOMEK-NXP自动化工作站将按每孔10μL试剂加入到96孔扩增板中。

1.3.2口腔细胞采集卡样本取样

设置BSD600型半自动打孔仪运行参数，使之在口腔细胞采集卡样本上打孔取样，选择靠近棉签转印区的部位，打下2至3片1.0mm的样本，置于已加入反应液的96孔扩增板中离心，待打取的样本完全浸入扩增试剂后扩增。

1.3.3扩增反应

95℃11分钟；94℃30秒，59℃2分钟，72℃1分钟，28个循环；60℃60分钟，25℃保存。

1.3.4电泳前加样

使用 BIOMEK-3000自动化工作站对扩增后产物按照PCR扩增产物1μL与9μL上样混合物比例混合后进行加样电泳。

1.3.5电泳检测及STR分型

通过3 1 3 0 X L型遗传分析仪电泳分离后，采用GeneMaperID v3.2分析软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 结果

通过采用生物样本自动打孔仪小孔径多点取样的方式，结合DNATyperTM19试剂盒对200份违法人员口腔细胞样本进行批量化直接扩增检验，其中196份样本得到了完整的STR分型，初检成功率高达98%（部分样本分型见图1），检验结果准确，无pull-up峰、非特异性人工产物等现象出现。此外，未获完整分型的4个样本，再次使用相同的检验方式后获得完整分型（数据未列出）。

2.2 讨论

图1部分口腔细胞采集卡样本的STR分型结果Fig.1Example of STR genotyping of buccal cell samples

张建等的研究表明，市售的口腔细胞采集卡含有荧光成分，直接扩增检验过程中，样本量过大会对样本的部分分型有荧光干扰[5]。本研究基于已有研究数据和本实验室的建库检验经验，采用生物样本自动打孔仪小孔径多点取样的方式结合应用DNATyperTM19试剂盒对口腔细胞采集卡样本进行直接扩增检验，避免了DNA提取等操作，极大简化了检验流程，节约检验时间和成本，且具备98%以上的初检成功率。BSD600型半自动打孔仪能够同时打出两片相同或不同尺寸的圆纸片，具有的光定位设备可以自动根据选择的打子孔数量及孔径准确定位，大幅增加通量，缩短工作时间。使用打孔仪的小孔径取样，避免了取样量过大造成的扩增干扰物的影响；多点取样的操作，增加了取准细胞的几率，提高了初检成功率（本研究中未获完整分型的4个样本，复检后获得完整分型，也从另一个方面证明了这一观点）。另外，本实验室使用的DNATyperTM19试剂盒可以同时扩增和检测18个STR基因座以及Amelogenin性别基因座，完全满足国家DNA数据库对位点数的要求[6～8]，本文研究建立的口腔细胞采集卡DNA分型快速检验模式能够实现检验我省普遍应用的口腔细胞采集卡的高效、快速检验，方法简便易行，进而节约了建库成本，对我省DNA数据库建设和法治建设有重大的现实意义。

[1] 赵兴春, 叶健. 法庭DNA技术的发展及展望. 刑事技术, 1998(5):42- 46.

[2] 葛百川, 郭红玲, 王穗保. 美国、加拿大DNA数据库概况及我国建立DNA数据库的思考. 刑事技术, 2001(4): 7-9.

[3] Dennis Y W, Chien W C, Nicola J O,et al.Direct amplification of STRs from blood or buccal cell samples. For ensic Science International: Genetics Supplement Series. 2009, 2(1): 113- 114.

[4] Dennis Y W, Chien W C, Lori K H. Rapid STR analysis of single source DNA samples in 2h. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2009, 2( 1) : 115- 116.

[5] 张建, 姜成涛, 赵兴春, 等. DNATyperTM15试剂盒直接扩增检验纸质样本的研究. 刑事技术, 2011(4): 33-35.

[6] 赵兴春, 姜成涛, 叶健, 等. DNATyperTM15试剂盒的法医学应用研究.中国法医学杂志, 2008, 23(3): 169-171.

[7] 张建, 赵兴春, 王乐, 等. 应用DNATyper15TMPlus试剂盒对遵义地区汉族人群18个STR基因座遗传多态性的调查.法医遗传学应用与进展, 2012: 176-180.

[8] 郑秀芬. 法医DNA 分析. 北京: 中国人民公安大学出版, 2002:385-387.