依达拉奉对大鼠星形胶质细胞水通透性的影响

李 颖，赵兴敏

0 引言

心脏骤停(Cardiac arrest,CA)后脑损害既是心肺复苏(Cardiopulmonary resuscitation,CPR)后的表现[1]，也是导致病情加重直至死亡的主要原因之一[2]。大多数幸存者复苏后表现为昏迷和意识障碍并最终出现慢性伤残[3]。水通道蛋白家族(Aquaporins，AQPs)是一组与水电解质运输平衡密切相关的选择性细胞膜转运蛋白。星形胶质细胞是大脑主要的细胞，心脏骤停复苏后会出现水肿。本研究通过构建缺氧复氧模型，观察依达拉奉对星形胶质细胞模型水通透性和水通道蛋白4(AQP4)的影响，以探讨依达拉奉是否在心脏骤停复苏后的水肿中具有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 大鼠星形胶质细胞原代培养 新生1～2 d Wistar大鼠乳鼠，经75%酒精消毒，断头处死，取脑放入冷的D-Hanks平衡盐溶液，去除脑膜及大血管。分离两侧大脑皮质并剪成1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃空气浴震荡消化10 min，用含10%FBS的DMEM培养基终止消化，1 000 rpm离心 10 min，去上清，再用含10%FBS的DMEM培养基重悬沉淀。经75 m筛网过滤，收集滤液，1 000 rpm离心 10 min，收集沉淀用含10%FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1.5×106/mL，种植于75 cm2培养瓶，经1 h差速黏附去除成纤维细胞后，将细胞悬液转移到一新的75 cm2培养瓶继续培养，2 d换液1次。7 d后将培养瓶放入水平摇床，37 ℃,260 rpm 2 h，换液弃除小胶质细胞，放入培养箱平衡1 h，重新置于水平摇床，37 ℃，260 rpm 18 h，换液弃除少突胶质细胞，用新鲜培养基洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA 1∶1混合液消化、传代备用。采用GFAP兔抗大鼠多克隆抗体进行星形胶质细胞纯度鉴定(GFAP阳性率达95%以上)。

1.2 实验分组 将GFAP阳性率为95%以上细胞经胰酶消化后，用新鲜DMEM稀释至1×104细胞/mL浓度。将细胞悬液分装至96孔板内，并将平板放于5%CO2培养箱中，37 ℃培养至平板底部60%有细胞为止。更换新鲜的10%FBS的DMEM培养基，置37 ℃、5%(体积分数) CO2、95%(体积分数) N2的培养箱内进行缺氧培养8 h，8 h后即刻将接入95%(体积分数)N2的接口断开，重新接入95%(体积分数)的空气进行复氧培养9 h。将96孔板分成如下各组：空白组：细胞直接培养至实验结束；对照组：细胞直接培养，直接进行缺氧和复氧操作；刺激组：在缺氧处理前，向细胞中加入依达拉奉至终浓度为0.1、1、10、100 μg/mL，然后进行缺氧和复氧操作。

1.3 细胞水通透性检测 取出不同时间(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各组3个孔的细胞，检测细胞对[3H]water (200 mCi/mL,Sigma)的通透性(Pd),结果以cm/sec表示。

1.4 Real time PCR 取出不同时间(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各组3个孔的细胞，胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400×g或1 700 rpm离心5 min，去上清，收集细胞。使用TRIzol Reagent试剂盒抽提细胞的总mRNA,并用DEPC水定量至5 μg/μL。使用PrimeScript One Step RT-PCR Kit将总mRNA拟转录成cDNA，并定量。特异性引物为：GAPDH-F:5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′,GAPDH-R:5′-GCTCCGGAAGATGGTGATGG-3′;AQP4F:5′-TGGTTCAGTGCTTCGGCCAC-3′;AQ-P4R5′-CCAGCAGTGAGGTTTCCATG-3′,均为上海生工合成。以GAPDH为内参，使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒和伯乐的IQ5 PCR系统扩增cDNA中的组织因子基因片段和GAPDH基因片段，反应条件设置为：95 ℃变性5 min，94 ℃变性30 s,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,30个循环，72 ℃延伸10 min。计算每个样品TF和GAPDH的△Ct，并采用△△Ct法计算每个样品中TF的mRNA转录倍数[14]。

1.5 Western Blot 取出不同时间(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各组3个孔的细胞，胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400×g或1 700 rpm离心5 min，去上清，用缓冲溶液[50 mM Tris-HCl,pH 7.4,150 mM NaCl,1%Nonidet P-40,0.5%deoxycholic acid,0.1%sodium dodecyl sulfate(SDS),5 mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA),2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF),20 μg/mL aprotinin,20 μg/mL leupeptin,10 μg/mL pepstanin A,and 150 mM benzamidine]重悬细胞至5×1010个。破碎后12 000 rpm离心20 min后取上清进行电泳。使用5%浓缩胶和15%分离胶进行电泳分离，并使用电转将蛋白转至PVDF膜上。10%牛奶封闭PVDF膜1 h，37度孵育一抗1 h，然后PBST清洗3次，每次5 min，然后用37度孵育二抗稀释液，并用PBST清洗3次，每次5 min。最后用ECL+plusTM Western blotting system kit (Amersham,USA)配置显光液，使用3490 photo gel imaging systems (Epson,Japan)拍照并记录，并用Image Pro PLUS软件分析每个蛋白与GAPDH的相对量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，所有计量资料比较均采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧和复氧过程中星形胶质细胞水通透性和AQP4表达 对原代培养的细胞缺氧8 h处理，然后复氧12 h，检测缺氧复氧过程中0 h、8 h、复氧后4 h、复氧后6 h和复氧后8 h星形胶质细胞水通透性和AQP4表达情况，结果见图1～图3。结果显示，缺氧阶段对照组和空白组水通透性、AQP4 mRNA和蛋白表达量差异均无统计学意义，复氧6 h和8 h时对照组水通透性、AQP4 mRNA和蛋白表达量均显著高于空白组。说明缺氧8 h和复氧6 h或8 h均可构建出星形胶质细胞水肿模型，且细胞水肿后AQP4表达量会上升。选择缺氧8 h和复氧6 h作为复氧模型构建方法。

图1 缺氧和复氧过程中星形胶质细胞水通透性变化情况

图2 缺氧和复氧过程中星形胶质细胞AQP4 mRNA表达情况

图3 缺氧和复氧过程中星形胶质细胞AQP4蛋白表达情况

2.2 依达拉奉对星形胶质细胞水通透性和AQP4表达的影响 取缺氧8 h和复氧6 h的星形胶质细胞作为缺氧复氧模型的构建方法。按照“1.2”中的方法对细胞进行刺激，在复氧6 h时检测各组细胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表达水平，结果见图4～图6。0.1 μg/mL依达拉奉刺激后，细胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05),1、10或100 μg/mL依达拉奉刺激后，细胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表达量显著低于对照组(P均<0.05),与空白组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

图4 不同浓度依达拉奉刺激后星形胶质细胞水通量变化情况

图5 不同浓度依达拉奉刺激后星形胶质细胞AQP4 mRNA水平变化情况

图6 不同浓度依达拉奉刺激后星形胶质细胞AQP4蛋白变化情况

3 讨论

本文探讨依达拉奉对缺氧和复氧后的星形胶质细胞AQP4表达以及细胞水肿的影响，结果如下：(1)缺氧8 h和复氧6 h或8 h可显著增加星形胶质细胞水通量以及细胞内AQP4 mRNA水平和蛋白表达，引起细胞水肿；(2)0.1 μg/mL依达拉奉刺激无法显著改变细胞水肿情况；(3)1、10或100 μg/mL依达拉奉刺激后,细胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表达量均显著下降。上述结果说明，1、10或100 μg/mL依达拉奉可通过抑制AQP4 mRNA水平和蛋白表达来达到显著抑制细胞水肿的效果。

依达拉奉是一种可以清除脑部自由基的药物，用于治疗脑梗死引起的神经病变[4-5]。大鼠实验显示，在缺血/缺氧再灌注后静脉给予依达拉奉，可阻止脑水肿和脑梗死的进展，并缓解所伴随的神经症状，抑制迟发性神经元死亡[6]。临床研究显示，依达拉奉可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤[6-7]。另外，大量的研究表明，脑梗死过程中会伴随脑水肿，主要表现为胶质细胞的水肿。胶质细胞水肿是一种常见的脑部损伤后再复苏的症状，是在脑部剧烈损伤后表现的一种脑部损伤。临床研究表明，药物可以抑制胶质细胞水肿，进而达到保护神经病变的作用[8]。内源性H2S抑制脑水肿是常见的临床现象，药物刺激也会抑制[9]。因此，依达拉奉很可能也会表现为抑制星形胶质细胞水肿的临床效果。本文的结果显示，1、10或100 μg/mL依达拉奉会抑制AQP4 mRNA水平和蛋白表达，从而达到显著抑制细胞水肿的效果。黄亮等[10]评价了依达拉奉干预后大鼠心肺复苏后脑AQP4表达与脑水肿动态变化，结果得出，心肺复苏后大脑水肿的同时，组织AQP4 mRNA和蛋白表达量均显著升高，但依达拉奉干预后大鼠脑水肿减轻，且AQP4表达量均下降，说明依达拉奉可通过降低脑组织内AQP4的表达量来达到减轻脑水肿的作用。尹泽黎等[11]发现，依达拉奉可通过清除自由基而发挥抑制脑水肿的作用。并且在临床上，依达拉奉联合血塞通注射液治疗可明显减轻脑水肿[12]。屈家虎等[13]使用亚低温联合依达拉奉也可使颅脑外伤后脑水肿减轻。张衍等[14]进一步阐述了依达拉奉抑制水肿的分子机制，明确了AQP4被抑制后细胞水肿也被抑制。本研究发现，依达拉奉可直接作用大脑主要的神经细胞星形胶质细胞，且与上述脑水肿类似的是，依达拉奉通过抑制AQP4表达，发挥抑制神经细胞星形胶质细胞的水肿。

本研究观察到依达拉奉对星形胶质细胞的水肿具有抑制作用，但尚未证明依达拉奉是通过抑制星形胶质细胞水肿来抑制脑部水肿，如需证明这一结论，需要在脑部组织检测组织内星形胶质细胞AQP4表达以及水肿情况。另外，由于本文是直接药物刺激，机体内依达拉奉是否直接刺激细胞或者通过相关途径发挥作用，还需要进一步去研究分析。

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