应用激光多普勒成像技术测量皮瓣成活面积的准确性分析＊

王友彬 吴焕文 肖一丁 高春锦 刘雪华 赵 岭 刘蕴琦 王晓军 马雪梅

皮瓣成活面积的测量是皮瓣研究的重要内容，其 测 量 方 法 有 纸 模 法［1，2］、照 片 图 像 分 析法［3，4］等。随着微循环测量技术的发展，人们开始研究根据组织循环血流状况确定组织成活的测量方法［5］，但用微循环灌注量来评估皮瓣成活情况以及这种判断结果是否与皮瓣的组织学成活状况相符合的研究目前未见报道。本文通过激光多普勒成像（LDI）技术和纸模法测量皮瓣成活面积的比较以及皮瓣组织病理学分析，评估用LDI微循环灌注方法判断皮瓣成活面积的准确性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠12只，体重250g-350g。大鼠在SPF级动物实验室饲养，环境温度22℃-25℃，实验过程中自由摄取饲料和饮水。

1.2 皮瓣手术方法

实验大鼠采用10%水合氯醛（0.3ml／100g）腹腔注射麻醉后，将腹部剃毛并设计大小约6cm×9cm的皮瓣。术区消毒铺巾，将皮瓣沿设计线切开，显露双侧腹壁下浅动脉，结扎并切断左侧动静脉，形成以右侧腹壁下浅动脉为蒂的腹部扩大皮瓣；用显微血管夹阻断皮瓣血供3h，恢复皮瓣血供后将皮瓣原位缝合；皮瓣下置相应大小的硅胶片。术后第5天每只大鼠均采用LDI和纸模法测量皮瓣成活面积，观察皮瓣边缘组织病理学变化。术后切口及皮瓣用无菌敷料包扎保护。

1.3 皮瓣成活面积测量方法

1.3.1 LDI测量法：用激光多普勒血流仪（LDF，PeriScan PIM3，Perimed AB，Sweden）完成。皮瓣手术后第5天，大鼠按上述方法麻醉后仰卧固定，充分暴露皮瓣部位，测量时环境温度保持在22-25℃。将LDF探头置于皮瓣区上部，设定观测范围为11.0cm×7.5cm大小，包括皮瓣及周围正常皮肤。对设定区域的皮肤血流灌注量进行测量后，LDF自动报告测定范围内不同部位皮肤血流量数据及不同颜色的图像。红色代表皮瓣血流灌注量最大，黑色代表最小甚至没有血流灌注，黄色和蓝色介于二者之间。图像颜色和皮瓣成活情况的关系是：红色、黄色以及与二者相连的蓝色区域视为皮瓣成活区，黑色视为皮瓣坏死区，蓝黑交界处视为皮瓣成活与坏死分界线。根据该分界线用移动鼠标在图像上人工标定皮瓣成活区（即红、黄和相邻部分蓝色区域），其面积值由与LDF配套连接的计算机自动计算生成（图1）。

1.3.2 纸模测定法：LDI测量完成后，肉眼观察皮瓣成活区（微红白色）和坏死区（黑灰色），将透明描摹纸覆盖在皮瓣上，用有色笔在纸上描出皮瓣坏死和成活范围（图2），通过扫描仪（HP M1536dnf，深圳）将成活皮瓣范围扫描成图像，用与扫描仪配套的Acrobat 7.0分析软件计算皮瓣成活面积。

1.4 皮瓣组织病理学分析

1.4.1 HE染色：于皮瓣边缘，即成活区和坏死区交界处取1×1cm2大小组织块，经甲醛（10%）固定、包埋、切片后行常规HE染色。光镜观察皮瓣成活与坏死组织的病理学表现，以验证皮瓣成活区标定准确性的组织学依据。

1.4.2 CD34染色：用于观察皮瓣组织内微血管形态。采用免疫组化Envision二步法，染色过程中设阳性及阴性对照。上述标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，徕卡切片机连续切片（厚5μm）。切片常规脱蜡、水化，经H2O2处理，阻断内源性过氧化酶。用山羊血清（北京中衫金桥公司，批号ZLI-9056）封闭处理后，依次滴加CD34鼠抗人单克隆抗体（北京中衫金桥公司，批号ZM-0046）和Envision二抗 （丹麦Dako生物制品有限公司，批号K4001），DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片后显微镜下观察。内皮细胞CD34表达于微血管内皮细胞，呈棕黄色。

1.5 统计学处理

数据用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学分析。皮瓣成活面积测量结果用均数±标准差（±s）表示，两种测量方法的结果比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种测量方法皮瓣成活面积比较

LDI技术测得的成活皮瓣面积为（10.19±3.27）cm2，纸模测量法测得的成活皮瓣面积为（10.21±3.15）cm2。两种方法测值比较，差异无统计学意义（t＝0.29，P＞0.05）。但由于大鼠腹部立体结构在纸模法测量时会对描绘图形产生影响，而LDI技术测量时结果几乎不受大鼠腹部立体结构的影响，因此两法划定的皮瓣和存活区范围有一定差异。

2.2 成活皮瓣边缘组织HE染色和CD34染色结果

2.2.1 HE染色：成活皮瓣边缘内侧均可见正常皮肤组织，而外侧出现明显炎性损伤组织，其真皮及皮下组织中有较多急性及慢性炎性细胞浸润，伴血管扩张充血，表皮角质层剥离、棘层增厚以及局灶性坏死形成（图3）。

2.2.2 CD34染色：成活皮瓣边缘内侧正常皮肤和皮下组织内微血管形态正常，血管腔多为类圆形；而外侧多数微血管管腔扩张、变形，部分血管闭塞，呈条索状（图4）。

［本文图1-图4见封2］

3 讨 论

在进行皮瓣研究时，皮瓣成活面积和成活率是重要的参考指标［6］。为确定皮瓣的成活面积，一些研究者先用纸模记录成活皮瓣的大小、形态，然后用面积分析软件计算成活面积的大小［1，2］，这种方法的测定结果存在对成活情况判断的主观误差。用数码相机记录皮瓣成活情况，然后用面积分析软件计算成活面积较前者简便［3，4］，但同样存在对皮瓣成活情况判断的主观误差。根据组织血供判断皮瓣成活状况并进行成活面积测定比上述方法更准确。随着LDF的发展和普及，其在皮瓣成活情况监测方面的应用越来越受到重视［5］。

LDI系统由激光光源发射器、快速接收器以及分析软件组成。激光被组织特别是组织血管中运动的红细胞散射，散射的光束因多普勒效应产生一定的波长变化，通过对这些光束的接收分析，即可测出红细胞的流动速度［7］。因此，LDI系统能较好地监测皮瓣的微循环血流灌注，判断皮瓣组织成活情况［8］，从而较准确地测量和计算皮瓣成活面积。

本实验结果显示，用纸模法和LDI两种方法测定皮瓣成活面积，其结果无显著差异。但和纸模法相比，用LDI技术测量皮瓣成活面积是通过皮瓣组织血流确定的，与通过主观判断确定成活边界的纸模法比较，测量结果更客观。另外，皮瓣边缘皮肤组织的HE和免疫组化染色显示，成活皮瓣有正常的血管形态和组织结构，而坏死区组织呈现血管扩张和管腔闭塞，皮肤组织炎性浸润和局灶性坏死，不可能给予皮瓣组织正常血供。这与LDI显示的坏死皮瓣局部血流量明显低于成活皮瓣相一致，为LDI测量成活皮瓣面积提供了组织学依据，即根据LDI确定的皮瓣成活面积，与实际成活皮瓣范围基本一致。采用LDI技术测量皮瓣成活面积的方法准确可靠。

为保证LDI技术测量的准确性，在用鼠标划定成活皮瓣范围时还需仔细观察皮瓣大体成活情况。因为LDI测定的是真皮下的血流，当皮肤坏死变薄时，LDI图像会因为深部正常组织的血流被测及而呈正常皮肤血流的颜色，从而产生较大的误差。所以在操作时应仔细观察扫描光斑在皮瓣上的位置及其相对应的图像颜色，尽量使鼠标划定的颜色范围与活体上真正成活皮瓣的面积一致。

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6 刘雪华，杨瑞年，郭昆华，等.高压氧对家兔随意皮瓣血管内皮生长因子和缺氧诱导因子的影响［J］.中华航海医学与高气压医学杂志，2008，15（4）：207-210.

7 Leutenegger M，Martin-Williams E，Harbi P，et al.Real-time full field laser Doppler imaging［J］.Biomed Opt Express，2011，2（6）：1 470-1 477.

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