猪肠道杯状病毒研究进展

刘小琬，周远成，黄 山，顾 凡，周桐枫，徐志文，朱 玲（.四川农业大学动物生物技术中心，四川 雅安；.四川省雅安市石棉县畜牧局，四川 雅安）

1980年，美国和英国的科学家使用电子显微镜检测腹泻的哺乳仔猪粪便样品时发现了一种新的病毒，后来根据其病毒形态将其命名为猪肠道杯状病毒（Porcineentericcaliciviruses,PE CV)。虽然PECV从发现至今已有近30年，但由于缺乏系统的病理学研究，到目前为止还不清楚它们在自然发生的猪病中所起的作用。PECV毒株在形态结构、基因结构和编码蛋白上与人杯状病毒（Humancaliciviru,HuCV）极其相近[1]，因此不同杯状病毒有可能存在潜在的跨物种交叉传播，以及猪可能是HuCV的储存宿主而把病毒传染给人，导致该病毒的流行。HuCV是引起人急性胃肠炎（Acutgastroenteritis,AGE）的主要病原之一，通过水、食物等途径引起AGE暴发和散发[2]，尤其是婴儿和幼儿的病毒性腹泻，对人类健康构成严重的威胁。目前还没有明确的证据表明现已知的PECV直接威胁到人类的健康。但对PECV抗原性和基因重组变化的检测，以及与Hucv进行遗传进化分析能更好的评估其患病率和人畜共患的潜力[3]。

1 病原学

杯状病毒科（Caliciviridae）的病毒粒子无囊膜，呈球形，在负染色电子显微镜下直径大约27～40nm，基因组为单股正链的RNA，大小约7000～8000nt[4]。病毒的非结构蛋白由病毒基因组的5’端编码，而结构蛋白位于病毒基因组的3’端[5]。最新的病毒学分类将杯状病毒分为五个属，分别是诺如病毒属（Norovirus,NoV）、札幌病毒属（Sapovirus,SaV）、水疱疹病毒属（Vesivirus）、兔病毒属（Lagovirus）和Nebovirus属。在通常情况下，杯状病毒在环境中较为稳定，病毒在高温下和某些化学物质（乙醚、氯仿等）作用下失活，PECV在pH 4.5～5的酸性条件下结构稳定。能够感染猪并引起猪发病的PECV主要是NoV和SaV，猪NoV只感染成年猪，且无临床症状；而猪SaV感染各年龄的猪尤其断奶仔猪，并可引起仔猪腹泻。

在1998年，NoVRNA在日本的成年猪盲肠样品中被检测到，随后在欧洲和美国陆续被发现。Noroviruses被分为5个基因型（GI-GV），其中GI有8个 亚 型，GII有19个，GIII有2个，GIV和GV各1个，其中GII各亚型中除11、18、19为猪的，其余均为感染人的亚型[6]。NoV直径为27～32nm，基因组长度为7.3～7.7kb，不包含聚腺核酸尾（poly（A））在3’端。它是由3个开放阅读框（openreadingframes，ORF） 编码的多聚蛋白，3个ORF之间有重叠，ORF3的下游是一个相对分子质量为42～78nt非翻译结构和一个长度不同的poly(A)连接在3’[7]。3个ORF分别用于编码非结构性多聚蛋白，主要衣壳蛋白（VP1）和次要衣壳蛋白（VP2）。VP1折叠形成表面光滑较为稳定的衣壳区（S区）和突出衣壳高度可变的拱形区（P区）。P区又包含P1和P2两个亚基凸域，通过序列比较，P2区的280～400氨基酸是高变区域，因此NoV是具有高度遗传变异特性的病毒。

SaV根据衣壳基因和蛋白质序列不同，分为5个基因型（GI-GV），每个基因群又有很多亚型，2011年Reuter等人又提出5个新的基因群即GVI-GX，人SaV基因组属于GI、GII、GIV和GV；感 染 猪的SaV基因组则归属于GIII、GVI、GVII、GVIII、GIX和GX，不同种属之间的基因重组也发生在猪SaV之间，且较人SaV而言进化时间更为长久[8]。世界首例PEC(Sw/SV/Cow den/80/US)于1980年在美国报道，分子生物学分析表明该毒株在遗传上与人SaV相近，氨基酸高度雷同，作同种系发生分组，PEC/Cow den被列为一个独立的SaV基因群，即基因组Ⅲ，而人SaV病毒属基因组Ⅱ。SaV病毒粒子在电子显微镜下具有典型的杯状病毒衣壳和形态清晰的杯状凹陷状，直径约为30～35nm，基因组长度在7.1～7.5kb。它只有2个ORF，这是SaV和NoV的主要差别，ORF1编码非结构多聚蛋白和衣壳蛋白，ORF2编码功能尚不清楚的小片段蛋白。猪扎幌病毒PEC/Cow den可在猪肾原代细胞和猪肾传代细胞系(LLC—PK)上培养，这是迄今为止唯一能培养的肠道杯状病毒。由于只对一分离物进行了详细研究，因而不清楚猪扎幌病毒间基因或抗原的变异。

2 流行病学

在美国、英国、荷兰、匈牙利和日本的猪群均报道有猪PECV的感染。美国存在SaV病毒，在荷兰和日本则有NoV病毒的流行，在英国和匈牙利未作基因分型。而根据美国、荷兰等国家的研究都显示了各年龄段的猪群SaV的感染率和血清阳性率均明显高于NoV，说明其流行更为普遍[9]。

猪NoV已经先后在日本、荷兰、美国、匈牙利、比利时、中国、韩国等国家检测出来[10]。值得一提的是，发生重组的人NoV的类病毒颗粒在猪胃肠组织的上皮细胞中发生了组织血型抗原结合，但此项发现并没有更多的数据来确定人、猪的NoV之间抗原性是否具有关联性。在日本(1977)26个猪群的1117头健猪盲肠内容物样本中，有4个样品RT-PCR检测为阳性。从荷兰(1998—1999)100个猪场的育肥猪中采集100个粪便混合样本，有2个为RT-PCR阳性。在美国（2007）采集到的275个成年猪猪粪便，有6个RT-PCR检测为阳性。同时也有人指出，检测猪NoV的PCR引物是根据人NoV而设计的，其灵敏性和特异性不高，在选择样品上也不够全面，未参考断奶前后的腹泻仔猪，因此对猪NoV的流行情况和发病率可能比实际情况更高。

猪SaV广泛分布于世界各地，近些年在美国、日本、荷兰等国猪群中分离到猪SaV[11]，且在不同国家的感染率不同，但通常是2～8周龄仔猪感染率最高。在美国的3个州的7个猪场的流行情况调查发现，不同猪场的流行率差异很大，在断奶后猪肠道杯状病毒腹泻的猪群中，收集30头母猪血清样本，有83%PEC/ Cow den抗体阳性[12]；同时保育猪及断奶仔猪未能检测到NoV。这与人类感染NoV情况类似，可能是由于幼龄仔猪对NoV不易感，也有可能是检测方法的灵敏度不高有关，还待进一步确定。在欧洲6个国家（丹麦、芬兰、匈牙利、意大利、斯洛文尼亚和西班牙）（2004-2007）88个猪场收集到1050个猪粪便通过RT-PCR确定其存在，其中有39个猪场检测到80个样品结果呈阳性，阳性率为48.75%（39/80）[13]。在我国黄泽彬等人对猪SaV的流行病学抽样调查发现，阳性率为12.70%（24/189）[14]。关于猪肠道杯状病毒与自然发病所知甚少，最近一项研究称，在西班牙对腹泻与未腹泻的断奶和未断奶猪，用电镜检查猪杯状病毒感染率并没有明显区别。在国内，有关猪SaV感染有少量报道，但对于猪NoV和SaV仍处于起步阶段。从目前已做过的非菌性胃肠炎暴发的调查中知道,许多都与被污染的食物或水有关,因此粪-口传播途径可能是该病的传播方式。

3 致病性研究进展

NoV还没有在体外培养成功，因此不能确定其理化和生物学特性。用人NoV的GⅡ人工感染无菌仔猪，74%（48/65）的仔猪出现轻度腹泻，病理组织学检查也显示在猪的小肠端出现轻度病变，超过58.06%（18/31）的抽样显示在肠上皮细胞发现了病毒复制。SaV人工感染猪实验表明该病毒具有一定的致病性和潜在危害，经口服和静脉注射均能造成感染，主要的病理变化通常在十二指肠和空肠。在组织学上可导致小肠绒毛萎缩、变钝、融合或缺失，隐窝细胞增生，并伴随细胞浆空泡形成及单细胞浸润。在临床上出现温和到严重的腹泻，参考对照组织培养液的猪均未出现症状。可通过抗血清免疫荧光试验证明病毒在肠细胞内复制并造成病毒血症的发生[15]，其感染机制并没有得到确认。

4 诊断方法

NoV和SaV的病原和抗体检测方法均有报道。通过电镜（EM）和酶联免疫吸附法（ELISA），能分别检测出完整的病毒颗粒和病毒抗原；RTPCR和荧光定量RT-PCR能检测出病毒RNA；重组病毒样颗粒则被广泛用作抗体ELISA检测血清抗体的抗原。使用电子显微镜进行病原检测灵敏度较低，且NoV没有特殊的杯状病毒形态，因此从形态学上很难将杯状病毒和其他肠道病毒如星状病毒、小核糖核酸病毒相鉴别。而使用IEM虽然可提高其灵敏度，但由于需要高度熟练的技术和昂贵的设备及耗费大量时间检测单个样品，因此电镜观察并不适用于做大量样品的分析。目前，最高效的检测方法是RT-PCR，它将病毒特定的核酸片段反转录合成cDNA，然后将cDNA进行PCR扩增。因为序列引物的设计具有较高特异性，该方法节约时间和成本，可用于多种病毒检测，因而成为常用的检测方法。但是由于NoV和SaV的高度遗传变异特性和多样性及样品的质量和特异性扩增的条件和方法的限制，目前还没有一种方法能完全准确地检测到所有型别的PECV。

5 预防、控制和治疗

目前对本病尚无特效治疗药物，主要靠加强饲养管理和卫生措施进行预防。由于可能存在隐形排毒和母猪通过初乳母源抗体限制新生仔猪感染和发病，环境中长期存在病原，病猪应隔离到清洁、干燥和温暖的猪舍，加强护理，尽量减少应激因素，对受污染的猪舍进行定期彻底的消毒，对发病和疑似患病猪粪便进行无害化处理。可给发病猪口服葡萄糖盐水或复方葡萄糖溶液进行对症治疗。

6 存在的问题

由于病毒的亚型众多，及在自然状态下发生重组现象，该病毒无法进行培养,不能建立动物模型，也没有简单敏感的诊断方法，都使得对该病毒的研究相对滞后，从而不能确定其流行范围和危害程度。对PECV在体内的复制、病毒和动物机体的相互作用、致病机理、免疫应答情况和相关疫苗都研究都甚少。因此对有效控制该病毒的传播造成很大困难。

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