猪体细胞核移植的影响因素

陈 思，罗光彬，王辉田，孙 超

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110161）

体细胞核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制，经过体外培养后，将发育良好的胚胎移植到动物体内的技术[1]。近年来，体细胞克隆猪在建立人的动物疾病模型和人类器官移植，进行基因工程药物生产和临床医学克隆治疗等方面具有巨大的应用潜力，己成为当今体细胞克隆研究的热点。尽管猪体细胞核移植已经取得了很大的进展，但移植效率依然很低，只有少量的重构胚胎能最终发育成为克隆动物；这是因为在猪的体细胞核移植过程中，实验操作步骤繁琐，影响因素较多，任何一个操作步骤和制约因素都将导致效率的降低或移植失败。为了提高猪体细胞核移植效率，有必要对猪体细胞核移植过程中的关键技术环节进行分析和优化，对影响猪体细胞核移植的因素进行探讨研究。

1 国内外猪体细胞克隆的研究现状

1997“多莉”羊诞生，揭开了体细胞克隆的序幕，2000年，Polejaeva等得到首例体细胞克隆猪之后，Onishi和Bet-thauser等相继分别成功地得到了体细胞克隆猪，2003年，Sanghwan等克隆出了表达强荧光蛋白的转基因猪，Jagdeece等克隆出了敲除α-1，3-半乳糖苷转移酶基因的克隆猪，从而为人类培育异种器官移植猪跨进了一大步。在国内，李宁教授已于2005 年成功培养出我国首例克隆猪[2]；窦忠英等用胚胎细胞核移植产生6头猪；魏庆信等得到了胚胎细胞核移植猪；李光鹏等把猪体细胞胚胎的细胞核通过电融合移植到去核的体内和体外成熟卵母细胞中，出生了2头克隆猪；孙兴参等获得了猪卵丘细胞克隆囊胚；2003年冯秀亮得到了人体细胞和猪卵母细胞异种核移植囊胚[3]。尽管如此，猪的体细胞克隆效率很低，与其他动物相比核移植难度更大，这是因为猪的卵子体外成熟胞质成熟不完全，发育能力不如体内获得的卵子；胞质较黑，较难显微操作；胞质内富含脂滴，对温度极其敏感；至少需要四枚优质胚胎才能建立和维持妊娠等。许多有关环节的机制还不清楚，本文就影响猪体细胞核移植主要因素的研究进展情况进行了综述。

2 供体细胞对核移植效果的影响

2.1 供体细胞的来源和种类对核移植的影响

多种组织来源的体细胞如乳房上皮细胞、各种成纤维细胞、卵丘/颗粒细胞、输卵管上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、睾丸支持细胞、神经细胞都可以用于克隆动物，但来源于不同组织或细胞种类的细胞的重编程能力和核移植效率明显不同。有些种类的供核细胞虽然能够得到克隆囊胚，但没有获得克隆后代；以克隆猪为例，目前只有猪的胎儿成纤维细胞和卵丘/颗粒细胞作为供体细胞成功地获得了核移植后代。张德福等对比了成纤维细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞等，发现成纤维细胞和颗粒细胞形成重构胚后囊胚发育率较高。

2.2 供体细胞动物年龄对核移植的影响

供体细胞的年龄对核移植效率存在一定的影响，多数研究表明，在核移植过程中，采用来源于胚胎和新生动物的细胞作为供核细胞，其克隆胚胎具有相似的囊胚发育率，但胎儿细胞却更容易得到健康的新生动物。这可能是由于胎儿细胞的分化程度较低，在重组胚中更容易启动重编程，而成体动物由于年龄较大，体细胞分化程度高，积累了较多的损伤和突变，因此导致重组胚胎发育能力降低。但也有研究认为，体细胞克隆胚胎的发育率与供体细胞动物的年龄无关。张运海研究认为在1～10代内不影响猪重构胚的发育能力。采用传代早期的细胞，这样似乎更有利于核移胚的发育，研究表明采用6～9代的供体细胞重构胚的发育能力较佳。Kubota研究5～15代之间重构胚发育能力差异不显著，Kasinathan等采用18代细胞为供核，不影响核移植重组胚的发育潜力[4]。

2.3 供核细胞的细胞周期对核移植的影响

细胞周期是指亲代细胞从分裂完成开始到子代细胞分裂结束所经历的时间，由G1、S、G2和M期组成，G1期为DNA合成的准备阶段，此时细胞核为二倍体，S期为DNA合成期，G2期是S期向分裂期过度阶段，该期细胞核为四倍体。研究认为，供体细胞的细胞周期也是影响核移植的一个重要因素，只有供核细胞和受体卵母细胞的细胞周期相协调时，卵母细胞的胞质才能有效对移入的核发生分化，并重新激活它的发育程序。

在动物核移植研究之初，认为供体核应该处于G1期或G0期，因为处G0和G1期的供体细胞不会因为DNA复制而产生多倍体。而G2和S期的细胞因DNA已合成或复制，会导致克隆胚发育不正常[5]。但在随后的研究中，赖良学等研究发现G2/M期的细胞能在去核MII期的猪卵母细胞中重新编程，并获得了体细胞克隆猪。此外，其他人的研究证实，G1、G2、M期的细胞均可用于核移植[6]。目前，除S期外，处于其他任何细胞周期的细胞都能成功用于克隆[7]。尽管如此，目前大多数实验仍是采用血清饥饿法和接触抑制法获得的GO/Gl期细胞，认为这种细胞较其他细胞周期的细胞更有利于重编程。

3 受体细胞对核移植效果的影响

3.1 受体细胞的选择及其影响

受体细胞所处的阶段对核移植的效果有着重要影响，在哺乳动物核移植研究中，作为受体胞质主要有三类：去核受精卵（原核胚胎）、2-细胞胚胎及去核MⅡ期成熟卵母细胞，其中卵母细胞的应用最为广泛。虽然采用去核受精卵的细胞作核受体已经得到克隆动物，但Singer等研究证明当用去核受精卵作核移植受体时，受体胞质所接受的胚胎核供体发育不能超过2～3细胞阶段，否则其重组胚无法正常发育。Wilmut研究认为处于MⅡ期卵母细胞有利于胚胎的重组，这是因为胚胎重组所需要的因子存在与MⅡ卵母细胞质中，在此时期，如转录因子等蛋白质从DNA螺旋轴中脱离，允许大量重组因子结合与DNA螺旋轴上，有利于重组发生。卵母细胞的体外成熟培养是获取大量受体细胞的主要途径；猪卵母细胞体外成熟培养及体外发育能力与成熟液和培养条件有密切的联系，现在普遍用两种基本的成熟培养基础液NCSU-23和TCM199。有人比较两种培养液的成熟效果，发现两者在成熟率上不存在显著差异，但其体外重组胚的发育差异显著。一般有2种培养条件。①38.5 ℃、5%的CO2、95%的空气；② 38.5 ℃、5% 的 CO2、5% 的 O2、90%的N2，研究表明在不同氧浓度下尽管囊胚形成率没有区别，但囊胚中的细胞数在氧浓度为5%时较多。选择合适卵龄的成熟卵母细胞作为胞质受体对核移植有很大的影响。一般选择成熟培养40～44 h的卵母细胞。

3.2 受体细胞去核方法及其影响

受体卵母细胞的完全去核是保证核移植胚胎发育的基本条件，如果去核不完全，可导致重组胚染色体的非整倍体性、卵裂异常、发育受阻和胚胎早期死亡。卵母细胞快速而准确的去核可避免孤雌发育，缩短体外操作时间，减少实验中的干扰因素。一般有以下几种方法[8]，①活性荧光染料（Hoeches33342）定位法，该方法去核准确，但染料和紫外线对卵母细胞有毒害作用，所以去核时间不能过长；②盲吸法，该法技术要求高、耗费时间长、对卵母细胞损伤严重、影响细胞质空间结构；③点压法，该法对卵母细胞质损伤较小，去核时不用换针，能有效提高去核效率；④化学诱导去核法，利用脱羰秋水仙碱的作用，使MII期卵母细胞排出第二极体，从而完成去核；⑤纺锤体探测技术，是利用Spindle-view偏振光系统，显示MII期染色体所处位置，并通过显微操作法去核，去核准确。

3.3 受体细胞注核的影响

按照供体细胞移入部位的不同，注核一般分为胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射一般用Piezoactuation（压电-陶瓷系统）微注射系统，直接把供体核注入胞质内。透明带下注射则把整个供核细胞注射至卵周隙，并需要融合。目前也有研究者直接把整个供核细胞注入胞质内，不需要融合而且效果非常好，其囊胚形成率达37%[9]。这可能是：①移入的供核细胞的细胞膜会逐渐在胞质受体中消失；②这样做不需要进行融合，减少了体外操作时间；③移入的胞质成分也许对重构胚的进一步发育很重要；④确保了DNA 能完全进入去核的卵母细胞，避免了获得供体核过程中对其结构的损坏，能更有效地支持重组胚的发育。

4 细胞融合对核移植效果的影响

当供核细胞通过带下注核移入除去细胞核的受体卵母细胞时，供核细胞仍然由独自的细胞膜包围着，只有通过细胞融合，才能使供核细胞与受体卵母细胞形成卵核复合体，也就是成为一个完整细胞继续培养。目前许多研究都是应用电融合技术进行融合，电融合是通过在短时间强电场的作用下，使细胞的双层膜产生可逆性击穿，当这种击穿发生在相邻的细胞膜接触区域时，两侧的细胞膜瞬间接触并融合。由于该方法重复性好、细胞毒性小、融合效果好，后来逐步被广大研究人员采纳，将电融合应用于胚胎细胞的融合，成为主要的融合方式。目前已有绵羊、牛、山羊、猪等动物采用电融合法获得了克隆动物[10]。对融合效率有直接影响的因素包括电脉冲强度、持续时间和脉冲次数等，电脉冲强度影响孔的数目和大小，持续时间影响微孔的存在时间[11]。另外，在施加直流脉冲前施加交流电，可以使细胞产生极化，促使细胞膜紧密接触并使接触面垂直于电极，从而提高融合效率。

5 激活对核移植效果的影响

在核移植过程中，因缺乏自然受精过程中的激活，需要使用物理或化学刺激，使卵母细胞激活后继续发育。Ca2+信号途径下游通路可导致卵母细胞激活，所以，创造一个短暂的Ca2+波动是激活过程的关键，但这个过程往往难以完全复制自然受精过程中Ca2+波动。Ozi和Hunean的研究认为[12]，Ca2+波动的幅度、数量、频度对早期胚胎的分裂影响不大，但Ca2+波动与胚胎发育的效率和质量有密切关系。目前主要有3种激活方案：①融合前激活，②融合同时激活，③融合后激活。激活后的卵母细胞，MPF活性降低，不会使移入其中的细胞发生PCC，阻止了G2期供体染色体的再复制现象，而Gl期和S期供体核仍可继续进行正常DNA复制，因而处于Gl，S，G2期的供核细胞仍继续原来的周期进程，保持正常核型。体细胞核移入去核的未激活的MII期卵母细胞后，在卵胞质中高活性MPF作用下，发生核膜破裂和染色体凝集。染色体的凝集将加速核与胞质中与核重编程相关蛋白因子的交换，促进基因组重编程的进行。染色体凝集也会对处于不同细胞周期的供体核倍性产生影响。处于Gl/GO期的细胞，因为DNA尚未复制，其核为二倍体，当染色质凝集后仍为二倍体，重构胚可以正常发育。G2期细胞作核供体时，由于DNA已复制，染色质凝集形成4倍体，必须使一半染色体以极体形式排出才能维持染色体的正常倍性，否则重构胚将维持异倍性而不能正常发育。而处于S期的供体核其DNA正处于复制过程中，此时发生PCC将使染色质形成“粉末状”形态，造成DNA严重损伤，重构胚不能正常发育[13]。

电脉冲和化学物质对能激活卵母细胞，但激活的同时不可避免地造成卵母细胞的损伤。因此，摸索出激活效率高，对卵母细胞损伤小的激活方法对胚胎的发育至关重要。

6 胚胎体外培养和胚胎移植对核移植效果的影响

胚胎的体外培养已有30多年的发展历史，体外培养技术作为基础技术广泛地用于胚胎工程各个方面，但胚胎体外培养的效率还不高，并且体外生产的胚胎染色体倍型的异常率较体内胚高出许多，rRNA基因的活性也明显不同，研究表明体外培养系统的缺陷也是导致胚胎吸收、死亡、流产、死胎或出生后死亡的一个重要方面，这说明现有各种培养系统还无法完全模仿体内环境，以适应早期早期胚胎分化发育的需求。这也就需要人们对早期胚胎的发育机制作更深地探索，在改善培养系统时，不只是单纯的通过添加或去除某种成分或改变某种物质的浓度来实现，而要从细胞代谢生理角度上摸索体外胚胎在早期发育过程中的实际需要，从而进一步了解早期胚胎的发育机制，进而提高体外生产胚胎的质量。

选择合适的培养液和培养条件对重构胚胎的发育至关重要，为了减少体外培养环境对胚胎发育的不利影响，猪体细胞重构胚胎要尽可能早地移植入雌性体内。克隆胚胎的移植方法和胚胎移植方法相同，关键是要保证移入胚胎的时期和受体母畜的生理周期一致。

7 存在的问题

尽管体细胞克隆猪研究已在理论基础、技术优化等方面取得很大的进展。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，还存在许多问题，比如核移植的效率很低、存活率低、核移植动物的异常发育、端粒长度缩短等问题，人们要提高动物克隆的成功率需不懈的努力。这些问题的解决，将有助于加深人们对动物胚胎发育的过程中分子机制的认识。因此，今后研究应该着重于有关核重新编程分子机制的研究以及胞质线粒体的影响等。

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