Fah-/-小鼠对NTBC的药物依赖性观察

彭雨婷，武 昕，孔祥平，李绍林,刘光泽

(1. 解放军第458医院全军肝病中心转基因工程室，广州 510602；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016)

延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, Fah)基因敲除小鼠，简称Fah-/-小鼠，是由Grompe等[1]建立的酪氨酸血症Ⅰ(tyrosinemia type I, HT1)小鼠模型。该模型由于Fah的缺失，导致酪氨酸代谢受阻，毒性代谢产物蓄积，引起肝、肾的严重损伤[2-3]。2-(2-硝基-4-三氟甲基苄基)-环己烷-1,3-二酮(NTBC)药物能够抑制酪氨酸降解通路中4-对羟基苯丙酮酸双氧化酶(4-HPPD)的活性，减少有毒代谢产物产生，临床上用于治疗高酪氨酸血症[4]。Fah-/-小鼠存在广泛而持续的肝损伤，可用于细胞移植、肝脏持续损伤、肝再生及肝癌的研究中[5-9]。本研究观察Fah-/-小鼠对NTBC的药物依赖性，更详尽的掌握该模型的生物学特征，使该模型得以更有效的利用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级balb/c品系Fah-/-小鼠，体重23～25 g，10周龄公鼠24只，10周龄孕鼠51只，受赠于厦门大学，由解放军第四五八医院动物实验中心饲养繁殖，饲养时饮用水中添加8 mg/L NTBC；SPF级balb/c品系野生型小鼠8只，体重23～25 g，10周龄，购自南方医科大学实验动物中心【SCXK(粤)2011-0015】，由解放军第四五八医院动物实验中心提供及饲养【SYXK(军)2012-0059】。正常进食。

动物饲养条件为：12h光照/12h黑暗节律，所有动物都用标准饲料和饮水饲养。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.1.2 主要试剂和仪器

2-(2-硝基-4-三氟甲基苄基)-环己烷-1,3-二酮 (NTBC)购自上海瑞博化学有限公司(CAS：104206-65-7)；苏木素、伊红购自福州迈新生物科技有限公司；中性树脂封片剂购自武汉博士德公司；石蜡切片机购自德国Leica公司；恒温烤箱购自北京医疗设备厂；正置显微镜购自日本Olymphas公司；不锈钢高压锅购自福州迈新生物科技有限公司；显微专业数码图像系统购自日本Olympus公司；十万分之一天平购自日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 观察NTBC对Fah-/-小鼠形态学和体重的影响

将24只10周龄Fah-/-小鼠分为三组：a.对照组(n=8)，服用NTBC；b.实验组1(n=8)，间歇停药，具体是停药3周后，持续给药2周，继续停药；c.实验组2(n=8)，停药不重复给药。记录小鼠生存状态，形态学变化，每周称重两次，取各组体重均值，绘制体重曲线。

1.2.2 血清学检测

Fah-/ -小鼠停药组在第1,2,3,4,5,6周眼眶采血，离心分离获得血清，检测血清中ALB,AST,ALT,ALP水平[10]。

1.2.3 肝脏病理学检测

1.2.3.1 制备组织切片

分别取Balb/c野生小鼠和NTBC停药第0,1,2,3,4,5,6周的Fah-/-小鼠小鼠的肝脏相同部位(0.8 cm × 0.8 cm × 0.3 cm)，生理盐水清洗，4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片。

1.2.3.2 苏木素、伊红(HE)染色

60℃烤片1 h，常规脱蜡水化，苏木素染色5～10 min，水中返蓝5～10 min，1%盐酸酒精溶液分化 3～10 s，水洗2 min，伊红复染5～10 min，水洗2 min，切片常规脱水透明干燥，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.4 NTBC对Fah- / -小鼠繁殖情况影响

统计2013年4月至2014年4月一年内Fah- / -小鼠每窝产仔数量，与野生型窝产仔数进行统计学比较[11]。

1.2.5 数据处理及统计分析

利用spss19.0统计分析软件对数据进行分析，统计分析采用重复测量方差分析和单因素方差分析。以α=0.05为检验水准，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NTBC对Fah- / -小鼠形态学和体重的影响

对照组：Fah-/-小鼠饮用水中一直给予NTBC，体重稳步增长，健康存活。实验组1：Fah-/-小鼠第一次停药，体重进行性下降，3周后体重为初始体重的70%～80%，有显著性差异(P< 0.05)，第3周饮用水中给与NTBC，第5周体重回升到初始体重后再次停药，体重维持一周后再次呈进行性下降，小鼠最终存活时间为7～10周。实验组2：从实验开始，Fah-/-小鼠停止给予NTBC，体重呈进行性下降，小鼠最终存活时间5～7周。体重曲线见图1。

Fah-/-小鼠停药后活力逐渐降低，3周后出现弓背，毛刺，连续停药5周后肢体行动不协调，易呈昏睡状，且体重明显减轻(P< 0.05)；如果再次给药，其状态、体重可逐渐恢复，生活状态也有所改善；死亡时体重约为初始体重的60%～70%。

注：对照组：持续给药NTBC；实验组1：间歇停药NTBC。实验组2：持续停药NTBC。

2.2 血清学指标检测

停药后，Fah-/-小鼠从第2周后ALB持续降低，ALT、AST、ALP指标逐渐升高，从第3周开始有明显的统计学差异(P< 0.01)(见图2)。

图2 Fah-/-小鼠去除NTBC后血清学指标随时间的变化曲线

2.4 肝组织病理学观察

对照组1：Balb/c野生型小鼠肝脏，肝组织结构完整，肝小叶轮廓清晰，细胞排列紧密有序，细胞形态饱满，胞浆充盈。对照组2：给药NTBC，Fah-/-小鼠肝脏病理学形态与野生型相似，无炎性病症。实验组：随着停用NTBC的时间的增加，肝脏正常组织结构消失，中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞逐步浸润，肝细胞由点状坏死向灶状、片状坏死发展，肝细胞索排列紊乱，细胞界限不清晰，体积增大，核收缩，胞浆疏松。4周后胞质内可见大量的脂肪空泡和气球样变性，肝细胞大量坏死并伴有严重的炎性病症和细胞凋亡(见图3,彩插1)。

2.5 NTBC对Fah- / -小鼠繁殖情况影响

2013年4月到2014年4月，一年中繁殖Fah-/-小鼠51窝，平均窝产仔7.29只，Balb/c野生鼠平均窝产仔7.56只。P> 0.05，Fah-/-小鼠窝产仔情况与Balb/c野生型无统计学差异。终身服药NTBC对Fah- / -小鼠繁殖能力无明显影响。

3 讨论

Fah-/-小鼠肝损伤原理同酪氨酸血症Ⅰ型的发病机制。酪氨酸血症Ⅰ型是一种少见的常染色体隐性遗传病，又称肝肾型酪氨酸血症，患病率约为1/2000至1/10 000。其发病机制主要是由于肝、肾组织中延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)活性降低或缺失，导致酪氨酸代谢途径的终端代谢发生障碍，不能正常代谢延胡索酸和乙酰乙酸。延胡索酰乙酰乙酸积累，其上游代谢物酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸升高，使中间代谢产物马来酰乙酰乙酸进一步积累，刺激产生旁代谢途径。马来酰乙酰乙酸和延胡索酰乙酰乙酸经旁代谢生成琥珀酰乙酰乙酸，后又再生成琥珀酰丙酮(SA)。这两种旁代谢产物可以与蛋白质的巯基结合，二者含量增高造成严重的肝损伤及肾小管缺陷[13-14]，肝细胞和肾小管上皮细胞的细胞凋亡是这种疾病的主要特征。目前，临床上通过琥珀酰丙酮诊断酪氨酸血症Ⅰ型。

2-硝基-4-三氟甲苯-1,3环乙垸碘(NTBC)，又称尼替西农，能够抑制酪氨酸降解通路第二步4-对羟基苯丙酮酸双氧化酶(4-HPPD)的活性，从而减少下游旁代谢途径中的有毒代谢产物，起到治疗作用。同时，NTBC抑制了酪氨酸向4-羟基苯丙酮酸的代谢，血酪氨酸增高，需控制蛋白质的摄取。总的来说，NTBC是替代肝肾移植治疗酪氨酸血症Ⅰ型最直接有效的方法。1992年，NTBC应用于临床治疗，生存率>90%。

Fah-/-小鼠通过敲除Fah基因，模拟酪氨酸血症Ⅰ型症状，肝损伤原理来自酪氨酸血症Ⅰ型的发病机制。Fah-/-小鼠在饲养过程中饮用水中添加8 mg/L的NTBC，不出现酪氨酸血症Ⅰ型病症，健康存活，生物学特性同野生型，是能够稳定遗传、易繁殖的小鼠模型。当NTBC停供，小鼠体重进行性降低，可低至初始体重的60%～70%，5～7周死亡，损伤持续稳定并未见自然恢复。生命活力3周后明显降低，并伴有弓背、毛刺的现象；5周后开始，精神不济，肢体不勤，弓背程度加重。肝损伤发生后重新喂药，损伤停止加剧，体重逐渐恢复。说明Fah-/-小鼠对NTBC有严重药物依赖性，不给与NTBC，Fah-/-小鼠不能存活，Fah-/-小鼠出现酪氨酸血症Ⅰ型症状。但有实验指出对Fah-/-小鼠进行多次的停药喂药实验,反复的肝脏损伤和再生还可以诱导肝癌的发生[15-16]。

血清学指标检测结果反映出肝脏呈持续性损伤。ALT与AST存在于肝细胞膜，能够反映出肝实质细胞膜通透性的变化。停药过程中，肝细胞逐渐坏死、凋亡，细胞膜破裂的同时释放ALT与AST到血液，使血清中二者水平升高。ALT、AST、ALP水平与肝损伤程度呈正相关，ALP水平变化不如ALT、AST显著；ALB水平与肝损伤程度呈负相关[12]，ALB降低呈现肝损伤加重。

停药后肝组织病理学和形态学特征变化具有阶段性，规律性，反映出不同阶段的细胞损伤情况，小鼠肝脏损伤的时间和程度可以通过NTBC药物的系统调节来进行控制。在连续给药的情况下，Fah-/-小鼠的各项生理指标、生物学特性和生殖情况与野生型小鼠基本一致。当对小鼠进行断药处理后，逐渐有炎性细胞侵润，发生炎症反应，肝细胞开始大规模坏死，胞质内形成大块脂肪空泡和气球样变性，停药后期肝细胞坏死伴随大量细胞凋亡，肝细胞发生细胞凋亡导致肝脏损伤。

Fah-/-小鼠对NTBC有依赖性，需终身服用，NTBC能通过抑制下游旁代谢途径中的有毒代谢产物产生来阻止Fah-/-小鼠肝损伤；Fah-/-小鼠模型可以很好的模拟人类酪氨酸血症Ⅰ型产生的各种症状，是研究该遗传病的理想模型；同时，该模型形成的持续性不可逆的肝损伤，也适用于研究外源细胞在小鼠体内的定植状况。因此，Fah-/-小鼠模型被广泛应用于相关的肝病基础研究、肝病细胞治疗、肝脏持续损伤、肝再生及肝癌的研究领域。

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